Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im neuromuskulären Bereich zu beantworten, wie die Rolle der Kalzium-Signalisierung in Muskel- oder Schwann-Zellen als Reaktion auf die Nervenstimulation. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass man die Aktivierung bestimmter Zelltypen als Reaktion auf die Nervenstimulation abbilden kann. Um zu beginnen, erhalten Transgene Mäuse, und genotyp sie wie im Textprotokoll detailliert beschrieben.
Nach Dereutasasien, quer Abschnitt über das gesamte Tier direkt unter der Leber und knapp über dem Herzen und der Lunge mit Iridectomie Schere. Sezieren Sie die Leber, das Herz und die Lunge. Achten Sie darauf, eine Länge des Phrenonischen Nervs zu halten, die lang genug ist, um in eine Saugelektrode gezogen zu werden.
Entfernen Sie den Rippenkäfig und die Wirbelsäule weiter, mit Ausnahme des dünnen Grats um das Zwerchfell. Legen Sie das Zwerchfell und die phrenische Nervenprobe in eine Mikrofugenröhre mit Krebs-Ringer-Lösung, die ein Mikrogramm pro Milliliter fluoreszierend alpha Bungarotoxin enthält. Lassen Sie die Probe in der Lösung für 10 Minuten im Dunkeln inkubieren.
Mit Minutienstiften wird das Zwerchfell immobilisiert, indem man es auf eine sechs Zentimeter große Schale fixiert, die mit Silikon-Dielektrikum-Gel beschichtet und mit etwa acht Millilitern sauerstoffhaltiger Krebs-Ringer-Lösung gefüllt ist. Legen Sie die Schale auf die Mikroskopbühne. Dann durchdringen Sie das Zwerchfell mit mehr Krebs-Ringer-Lösung bei acht Milliliter pro Minute für 30 Minuten.
Bei vierfacher Vergrößerung, mit einem Mikromanipulator, bewegen Sie die Saugelektrode über den linken Phrenonalnerv. Tragen Sie die Saugkraft auf, indem Sie den Lauf einer Fünf-Milliliter-Spritze herausziehen, die mit dem Schlauch verbunden ist, der an der Saugelektrode befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass sich die Membran als Reaktion auf die Einhertz-Stimulation zusammenzieht, indem Sie sie visuell mit Brightfield-Beleuchtung untersuchen.
Wenn nicht, stellen Sie die Spannung ein, indem Sie den Spannungsknopf inkrementell drehen, um einen supramaximalen Impuls zu erreichen, der durch visuelle Untersuchung der Muskelkontraktion überprüft werden kann. Wenn immer noch nicht sichtbar, blasen Sie den Nerv mit der Spritze und versuchen, es wieder durch Aufbringen von Saugung zu ziehen. Schalten Sie nun die Perfusion aus, um den muskelspezifischen Myosin-Inhibitor BHC oder den spannungsverzerbten Natriumkanal-Antagonisten Mu-Conotoxin hinzuzufügen.
Bereiten Sie die BHC-Vorverdünnung vor, indem Sie vier Mikroliter 200 Millimolar-Lager BHC in DMSO in einem Milliliter Krebs-Ringer-Lösung pipetieren. Entfernen Sie einen Milliliter Krebs-Ringer-Lösung aus der Schale. Dann den vorverdünnten BHC in die Schale geben.
Nach 30 Minuten die Durchblutung der frischen Krebs-Ringer-Lösung für weitere 20 bis 30 Minuten einschalten. Tragen Sie Handschuhe, bereiten Sie die Aufnahmeelektrode vor, indem Sie ein Borosilikat-Filamentglas mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter und einem Innendurchmesser von 0,4 Millimetern in einen Mikropipette-Zieher legen. Ziehen Sie die Zifferblätter fest, um sie in Position zu klemmen und die Abziehertür zu schließen.
Programmieren Sie dann den Puller, wie im Textprotokoll beschrieben. Bei embryonalen Membranen den Widerstand mit Softwaresteuerungen des Verstärkers messen. Stellen Sie sicher, dass der Widerstand in der Nähe von 60 Megaohm und für ältere Membranen, 10 bis 20 Megaohm.
Laden Sie nun die Aufnahmeelektrode mit drei Molkaliumchlorid. Bei der 10-fachen Vergrößerung senken Sie die Elektrode in den Muskel mit einem zweiten Mikromanipulator auf der gegenüberliegenden Seite der Bühne als stimulierende Elektrode. Mit hilfe elektrophysiologischer Datenerfassungssoftware warten, bis sich das Potenzial der ruhenden Membran von null auf minus 65 Millivolt oder darunter ändert.
Stimulieren Sie bei einem Hertz und überprüfen Sie das Vorhandensein eines Muskelwirkungspotenzials, indem Sie auf ein großes Potenzial überprüfen, das eine bescheidene Überschreitung aufweist. Verwechseln Sie Stimulationsartefakt nicht mit einem Aktionspotenzial. Bei 20-facher Vergrößerung lokalisieren Sie das Endplattenband in der Mitte des Muskels, indem Sie unter grüngelber Lichterregung nach fluoreszierend markierten neuromuskulären Knoten alpha-Bungarotoxin suchen.
Wechseln Sie zu Blaulicht-Erregung, um Kalzium-Antworten in Muskel-, Motorneuron- oder Schwann-Zellen zu erhalten. In diesem Beispiel wird GCaMP drei in Muskelzellen exprimiert. Richten Sie auf Wunsch den Bildteiler mit Bandpassfiltern und einem dichroitischen Einkantfilter für die Dual-Wellenlängen-Bildgebung ein.
Führen Sie Experimente mit dem Helligkeitsbalken auf dem Aufsuchtischbalken durch, der auf 110 % des Niveaus eingestellt ist, auf dem der genetisch kodierte Kalziumindikator, der Gewebe ausdrückt, eine Sättigung bei 20-facher Vergrößerung aufweist, ohne als Reaktion auf Kaliumchlorid zu binning. Rekord mit 20 Bildern pro Sekunde, um keine schnellen Events zu verpassen. Stimulieren Sie mit einer bis 45 Sekunden von 20 bis 40 Hertz Nervenstimulation, indem Sie einen Impulszug mit einer Saugelektrode liefern und dynamische fluoreszierende Calciumreaktionen in einer Zelle zusammen mit dem statischen fluoreszierend als Alpha-Bungarotoxin-Neuromuskelknotensignal bezeichneten Neuro-Bungarotoxin-Knotensignal sammeln.
Pharmakologische Agonisten können auch durch Badapplikation oder per Perfusion hinzugefügt werden und die dynamischen fluoreszierenden Calciumreaktionen können auf die gleiche Weise gesammelt werden. Wenn die bildgebenden oder elektrophysiologischen Experimente abgeschlossen sind, weil die gewünschten Ergebnisse erzielt wurden, durchdringen Sie Wasser durch die Perfusionsleitungen und saugen Sie Wasser zwei- bis dreimal durch die Saugelektrode, um sicherzustellen, dass sich Salze nicht bilden. Eine räumliche Karte der Schwann-Zell-Calciumreaktionen auf die phrenische Nervenstimulation eines Wnt ein GCaMP Drei-Maus-Membran am postnatalen Tag sieben zeigen eine Beschränkung auf terminale parasynaptische Schwann-Zellen an der neuromuskulären Kreuzung.
Das gleiche Zwerchfell wurde nach der Kennzeichnung mit fluoreszierend markiertem Alpha-Bungarotoxin abgebildet, das sich bindet, um Acetylcholin-Rezeptoren der neuromuskulären Kreuzung zu ermöglichen. Das gleiche Zwerchfell wurde auch unter Brightfield-Beleuchtung abgebildet, um eine Aufnahmeelektrode in den postsynaptischen Bereich des Muskels durch die neuromuskuläre Kreuzung zu führen. Hier ist die räumliche Abgrenzung von farbcodierten Zellen oder Interessengebieten zu sehen, die für die Analyse einzelner Kalziumtransienten genutzt werden.
Die räumliche Karte der Muskelzell-Calcium-Antworten eines mth 5 GCaMP drei Maus-Membran bei P vier zu phrenischen Nervenstimulation in Gegenwart des Myosin-InhibitorS BHC zeigt eine Reaktion in der gesamten Region aller Membranmuskelzellen. Im Gegensatz dazu verursacht die Stimulation des gleichen Zwerchfells in Gegenwart von Mu-Conotoxin eine räumlich eingeschränkte Kalziumantwort im medialen Bereich aller Membranmuskelzellen, die dem Acetylcholin-Rezeptor-Cluster-angereicherten Endplattenband entspricht. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Immunhistochemie oder Immunoblotting durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. Wie hoch ist das molekulare Profil von Zellen, die durch Elektrophysiologie oder Kalzium-Bildgebung identifiziert werden?
Diese Methode kann Einblick in die Reaktion der Bevölkerung von Schwann-Zellen und Muskelzellen auf die Nervenstimulation bei normalen neonatalen Mäusen geben. Es kann auch auf die Untersuchung von älteren Mäusen oder auf die Studie von Mäusen angewendet werden, die neuromuskuläre Krankheit assoziierte Proteine exzessiös ausdrücken.
