Il misfolding della rodopsina causa una progressiva degenerazione retinica chiamata retinite pigmentosa. Mentre un metodo di imaging tradizionale ha una capacità limitata di quantificare il trasporto della rodopsina, questo saggio basato su immagini di nuova sviluppo consente uno screening ad alta produttività, eliminando i falsi positivi. Questa tecnica consente una rapida valutazione della farmacodinamica del farmaco.
Nell'occhio di salvare il ripiegamento della rodopina che causa la malattia, accelerando così il potenziale per un trattamento per la malattia tranquillamente intrattabile e accecante, la retinite pigmentosa. La localizzazione cellulare di una proteina di membrana è molto importante per la sua funzione. Questo metodo può essere facilmente modificato e applicato per quantificare il trasporto di qualsiasi altra proteina di membrana di interesse.
Assicurarsi di preparare una mappa della piastra e aggiungere e aspirare delicatamente il liquido da ogni pozzo della piastra, per mantenere il numero di cellulare e le condizioni di stato immuno coerenti tra le cellule. Ciò produrrà un fattore Z elevato e risultati affidabili. Per iniziare, seminare 5000 cellule per pozzo in un fondo nero con pareti chiare, polilisina trattata con 384 polietilene.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di CO2 per tre ore affinché le cellule si attaccano al fondo della piastra. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 10 microlitri per pozzo di soluzioni di lavoro 5X, secondo una mappa della piastra predeterminata come quella mostrata qui. Aggiungere ora 10 microlitri per pozzo del 2%DMSO alle colonne 22 e 24.
Inoltre, aggiungere 10 microlitri per pozzo di 25 micromolari 9-cis-retina alla colonna 23 in una stanza buia sotto la luce rossa fioca. Al termine del caricamento di tutti i vari composti di prova, coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Estraete la piastra a 384 punti in una stanza buia con luce rossa fioca.
Qui, utilizzando aspiratore a 8 canali, collegato a una bottiglia di raccolta del vuoto, per aspirare delicatamente il mezzo dai pozzi della piastra. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 20 microlitri per pozzo di paraformaldeide appena preparata al 4% all'intera piastra di 384 pozzi e fissare le celle per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, posizionare la piastra nella luce normale.
Lì, utilizzare un aspiratore a 8 canali, per aspirare la Paraformaldeide in ogni pozzo, e utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri per pozzo di PBS. Aspirare e sostituire il PBS per un totale di tre cicli di lavaggio. Quindi, aggiungere 20 microlitri per pozzo del 5% di siero di capra ad ogni pozzo e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, aspirare i pozzi e aggiungere 15 microlitri di 20 microgrammi per millilitro anticorpo anti-rodopsina B630, nell'1% siero di capra ai pozzi nelle file da A a O.Successivamente, aggiungere 15 microlitri per pozzo dell'1% di siero di capra alla riga P per il gruppo di controllo solo anticorpi secondari. Incubare il piatto a temperatura ambiente per 90 minuti o a quattro gradi Celsius durante la notte. Quindi, coprire la piastra con un foglio di alluminio per evitare il fotolicenza dei fluorofori.
Quindi, lavare la piastra tre volte con 50 microlitri per pozzo di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare il PBS e aggiungere 15 microlitri per pozzo di cinque microgrammi per millilitro di anticorpo IgG di capra coniugato Cy3. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare i campioni a temperatura ambiente per un'ora.
Dopo l'incubazione, lavare il piatto tre volte. Quindi, aggiungere 50 microlitri per pozzo di PBS, contenenti un microgrammo per millilitro di macchia hoechst a temperatura ambiente per 15 minuti. Infine, sigillare la piastra del pozzo con una pellicola trasparente, coprirla con un foglio di alluminio e conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana.
Rimuovere il foglio e posizionare la piastra campione in un imager ad alto contenuto, con A1 posizionato nell'angolo in alto a sinistra della piastra. Aprire quindi il software di acquisizione immagini per impostare i parametri per l'acquisizione delle immagini. Aprire la finestra di impostazione dell'acquisizione delle lastre e creare una nuova impostazione o caricare un file di installazione esistente.
Selezionare l'obiettivo 20X e impostare il binning dei pixel come due, in modo che la dimensione dei pixel calibrata sia di 0,80 per 0,80 micron. Quindi, impostare le linee di scansione come 2000 e le dimensioni dell'immagine come 1000 per 1000 pixel per sito. Selezionare quindi il tipo di lastra da imaged.
Utilizzare le informazioni fornite dal produttore per compilare le dimensioni della piastra. Ora, seleziona i pozzi da imageare insieme a quattro siti da immagini per pozzo. Evitare il lato del pozzo, che viene toccato dalle punte di aspirazione.
Per l'imaging, selezionare i laser di eccitazione come 405, 488 e 461 nanometri. Quindi, selezionare i filtri di emissione per i canali DAPI, FITC e Texas Red. Ottimizza la potenza laser e i guadagni di ogni canale, per garantire che i pozzi di controllo positivi non siano saturi.
Selezionare bene per mettere a fuoco bene per la messa a fuoco automatica. Quindi, selezionare il pozzo iniziale da acquisire e impostare lo stato attivo automatico del sito per tutti i siti. Inoltre, selezionare quattro medie per linea per ogni canale e ottimizzare il valore di offset Z per ogni canale.
Convalidare, che tutto sia impostato correttamente, testando prima da due a tre pozzi agli angoli della piastra, per assicurarsi che le immagini siano a fuoco per tutti i pozzi testati. Quindi, controlla, che le immagini di tutti i siti per pozzo abbiano celle con più del 40% di confluenza. Infine, verificare che le intensità di fluorescenza in tutti i canali siano tutte circa la metà sature nei pozzi di controllo al 100%.
Quindi, salva il metodo di acquisizione dell'immagine ed esegui l'intera piastra. Guardare l'imager fino al termine dell'acquisizione delle immagini dalla prima colonna della lastra per ricontrollare la qualità dell'immagine prima di uscire dall'imager. Al termine, rimuovere la piastra e conservarla a quattro gradi Celsius per un uso futuro.
Estrarre i dati delle immagini, utilizzando un software di analisi delle immagini ad alto contenuto. Selezionare uno dei pozzi di controllo al 100% nella colonna 23 per impostare i parametri. Selezionare innanzitutto il punteggio della cella a più lunghezze d'onda come metodo di analisi e iniziare a configurare le impostazioni aggiuntive.
Definire i nuclei utilizzando le immagini del canale DAPI. Anteprima, per assicurarsi che le forme dei nuclei definiti nel pozzo selezionato si adattino bene alle immagini dei nuclei. Successivamente, definire la forma della cella nel canale FITC, dove viene immagine Venere rodopsina.
A tal fine, impostare diametri minimi e massimi di ogni cella, intensità minima di fluorescenza sopra lo sfondo e area minima di ogni cella. Ora, definite le aree di macchie superficiali delle cellule rodopsine nel canale rosso del Texas, impostando i diametri minimi e massimi della forma cellulare, l'intensità della fluorescenza del minium sopra lo sfondo e l'area minima di ogni cella macchiata. Testare l'algoritmo corrente in cinque pozzi per determinare se le impostazioni sono ottimizzate.
Salvare quindi le impostazioni e chiudere la finestra di configurazione. Eseguire tutti i pozzi con il metodo di analisi ottimizzato. Al termine, esportare il numero dell'oggetto come numero di cella intatto.
Esportare l'intensità media del canale FITC come intensità di Venere rodopsina ed esportare l'intensità media del Canale Rosso del Texas come intensità rodopsina sulla superficie cellulare. Utilizzare il software del foglio di calcolo per generare una mappa termica a due colori per ogni parametro. Disporre il nome delle linee cellulari sull'asse x e i composti sull'asse y.
Qui, le nostre immagini della rodopsina P23H Venus hanno trattato le cellule U2OS, esprimendo la fluorescenza di Venere in verde, e l'immuno-colorazione della superficie cellulare in rosso. Le cellule sono state trattate con DMSO o cinque micromolari 9-cis-retiniche. Il saggio di trasporto della rodopsina, confrontando la quantità di rodopsina nell'intera cellula in varie condizioni, mostra un recupero significativo nella linea cellulare mutante P23H, se trattata con 9-cis-retinica.
Inoltre, l'intensità della rodopsina sulla superficie cellulare, e il rapporto tra la macchia di rodopsina sulla superficie cellulare e l'intensità di Venere rodopsina nell'intera cellula, non sono significativamente inferiori per il mutante P23H, rispetto al rombopsina wildtype trattato con DMSO. Una mappa termica è un modo efficiente per confrontare la quantità media di rodopsina e la localizzazione per cellula tra più mutanti. Qui, i controlli del tipo selvatico e sei mutanti rodopsina sono elencati orizzontalmente e gli effetti dei trattamenti composti vengono confrontati verticalmente.
In accordo con studi precedenti, l'intensità della rodopsina sulla superficie cellulare e il rapporto tra la macchia di rodopsina sulla superficie cellulare e l'intensità di Venere rodopsina sono inferiori per i sei mutanti rispetto al tipo selvaggio trattato con DMSO. I composti uno, due, sei e nove hanno aumentato significativamente il rapporto tra la macchia di rodopsina sulla superficie cellulare e l'intensità di Venere rodopsina nei mutanti T4R, P23H, D190N e P267L rodopsina, suggerendo che questi composti salvano il trasporto di questi mutanti rodopsina alla membrana plasmatica. Tenere presente che le celle devono essere tra il 50 e il 70% confluenti prima della fissazione, in quanto ciò è fondamentale per l'analisi delle immagini.
Inoltre, abbiamo mostrato le immagini di un pozzo su tutto il piatto. Assicurati che le immagini a fuoco e che la fluorescenza, che non esce, abbia tutto il valore di soglia per qualsiasi canale. Fino a una selezione di composti, che salvano il trasporto di rodopsina con piegatura errata, possiamo convalidare il processo, quindi passare l'efficacia di questi composti in vivo, usando un modello di topo che esprime il mutante rodopsina P23H.
Questo metodo ci permette di quantificare la quantità di proteine della membrana e la sua localizzazione. Pertanto, è un ottimo strumento per micro errore iniziato sulla proteina della membrana per aiutare il salvataggio e la degradazione. La paraformaldeide, come in questo esperimento, ha procedure che comportano la manipolazione di questo reagente.
Sarà fatto sotto il cofano. I rifiuti, compreso questo reagente, dovrebbero essere adeguatamente smaltiti come sostanze chimiche pericolose.
