罗多普辛错误折叠导致渐进性视网膜退化称为视网膜炎色素。虽然传统的成像方法对杜多普辛传输的定量能力有限，但这种新开发的基于图像的检测允许高吞吐量筛选，从而消除误报。该技术允许快速评估药物药罪。
在抢救致病性罗多普辛的折叠，从而加速了治疗悄悄地无法治疗和致盲疾病，视网膜炎色素沙的潜力。膜蛋白的细胞定位对它的功能非常重要。该方法可以很容易地修改和应用，以量化任何其他膜蛋白的运输感兴趣。
确保准备一个板图，轻轻地添加和吸气液体从板的每个井，以保持细胞数量和免疫状态条件之间的一致性。这将产生高 Z 因子和可靠的结果。首先，每井播种5000个细胞，进入一个黑壁，透明的底部，多晶烯处理384井板。
在37摄氏度下用5%的CO2孵育板，使细胞附着在板的底部3小时。接下来，使用多通道移液器，根据预先确定的板图，每井添加 10 微升 5 倍的工作解决方案，如此处所示。现在，将每井 2% DMSO 的 10 微升添加到第 22 列和 24 列。
此外，在昏暗的红灯下，在黑暗的房间里，每井添加 10 微升 25 微摩尔 9-cis-视网膜到柱中。装载完所有各种试验化合物后，用铝箔盖住板，并在37摄氏度下孵育24小时。在暗红灯昏暗的房间里拿出384个井板。
在这里，使用8通道吸气器，连接到真空收集瓶，从板的孔温和吸气介质。接下来，使用多通道移液器，将新准备的4%甲醛每井添加20微升，并在整个384井板中固定细胞20分钟。固定后，将板放入正常光线中。
在那里，使用8通道吸气器，在每一个井中吸气，并使用多通道移液器每井PBS添加50微升。吸气并更换 PBS，总共三个洗涤周期。然后，在每井中加入20微升，每井5%山羊血清，并在室温下孵育板30分钟。
孵育后，吸气井，并加入15微升，每毫升20微克B630抗多多普辛抗体，在1%山羊血清到井A行到O.Next，添加15微升每井1%山羊血清到行P为二级抗体只对照组。在室温下孵育板90分钟，或在夜间4摄氏度。然后，用铝箔盖住板，避免荧光团的光漂白。
接下来，用每井 PBS 50 微升清洗板三次。上次洗涤后，吸吸PBS，每毫升Cy3结合山羊抗小鼠IgG抗体每孔添加15微升，每毫升5微克。用铝箔盖住板，在室温下孵育样品一小时。
孵育后，洗盘子三次。然后，每孔PBS添加50微升，在室温下每毫升霍赫斯特染色含有1微克，15分钟。最后，用透明薄膜密封井板，用铝箔盖住井板，并在四摄氏度下储存长达一周。
取出铝箔，将样品板放入高含量成像器中，A1 位于板的左上角。接下来，打开图像采集软件，设置图像采集参数。打开板采集设置窗口并创建新设置或加载现有设置文件。
选择 20 倍目标并设置像素装箱为两个，因此校准的像素大小为 0.80 x 0.80 微米。然后，将扫描线设置为 2000，将图像大小设置为每个站点 1000 x 1000 像素。接下来，选择要成像的板类型。
使用制造商提供的信息填充板材尺寸。现在，选择要成像的井以及每个孔要成像的四个站点。避免井的一侧，这是接触的吸气技巧。
对于成像，请选择 405、488 和 461 纳米的激励激光器。然后，选择 DAPI、FITC 和德州红色通道的排放过滤器。优化各通道的激光功率和增益，确保正控井不饱和。
选择好以做好自动对焦。然后，选择要获取的初始井，并设置所有站点的站点自动对焦。此外，为每个通道选择每条通道四个平均值，并优化每个通道的 Z 偏移值。
通过首先在板的角落测试两到三口井，验证所有已正确设置，以确保图像在所有测试的孔上聚焦。接下来，检查每个井中所有站点的图像具有超过 40% 汇合的细胞。最后，检查所有通道的荧光强度在100%控制井中是否都饱和了一半。
然后，保存图像采集方法，并运行整个板。观看成像器，直到它完成从板的第一列捕获图像，在离开成像器之前仔细检查图像质量。完成后，取出盘子并将其存放在四摄氏度，供将来使用。
使用高含量图像分析软件提取图像数据。选择第 23 列中的 100% 控制井之一以设置参数。首先，选择多波长细胞评分作为分析方法，并开始配置其他设置。
使用来自 DAPI 通道的图像定义核。预览，以确保所选中定义的核形状与核图像完美贴合。接下来，定义 FITC 通道中的细胞形状，其中对罗多普辛金星进行成像。
为此，设置每个细胞的最小和最大直径，背景上方的最小荧光强度，以及每个细胞的最小面积。现在，通过设置细胞形状的最小和最大直径、背景上方的最小荧光强度以及每个染色细胞的最小面积，定义德州红通道中的罗多普辛细胞表面染色区域。在五个孔中测试当前算法，以确定设置是否经过优化。
然后，保存设置并关闭配置窗口。使用优化的分析方法运行所有油井。完成后，将对象编号导出为完整的单元格编号。
导出 FITC 通道的平均强度为罗多普辛金星强度，并导出德州红通道的平均强度为细胞表面的罗多普辛强度。使用电子表格软件为每个参数生成双色热图。排列 x 轴上的单元格线名称和 y 轴上的化合物。
在这里，我们的P23H红斑松金星图像治疗U2OS细胞，表达金星荧光的绿色，和细胞表面免疫染色的红色。细胞要么用DMSO治疗，要么用5微摩尔9-cis-视网膜治疗。罗多普辛传输测定，比较不同条件下整个细胞中的罗多普辛量，显示P23H突变细胞系在用9-cis-视网膜治疗时有显著的恢复。
此外，与用DMSO治疗的野生罗多普辛相比，细胞表面的罗多普辛强度与整个细胞中的罗多普辛金星强度的比例并不明显降低。热图是比较多个突变体中每个细胞的平均罗多普辛数量和定位的一种有效方法。在这里，野生型对等6个罗多普辛突变体水平列出，并垂直比较复合治疗的效果。
与先前的研究一致，与用DMSO治疗的野生型相比，细胞表面的罗多普辛强度和细胞表面的罗多普辛染色与罗多普辛金星强度的比例较低。化合物一、二、六和九显著增加了细胞表面的罗多普辛染色与T4R、P23H、D190N和P267L罗多普辛突变体中罗多普辛金星强度的比例，表明这些化合物能够拯救这些罗多普辛突变体向血浆膜的运输。请记住，在固定之前，细胞需要介于 50 到 70% 的汇合之间，因为这对图像分析至关重要。
此外，我们展示了整个板块的井的图像。确保焦点图像，以及不退出的荧光具有任何通道的所有阈值。到选择化合物，即救援错误折叠的罗多普辛运输，我们可以验证的过程，然后通过这些化合物的功效在体内，使用小鼠模型表达罗多普辛P23H突变。
这种方法使我们能够量化膜蛋白量及其定位。因此，它是一个伟大的工具，在膜蛋白每个辅助保存和降解开始微错误。与本实验中一样，准甲醛有涉及处理该试剂的程序。
它会在引擎盖下完成。包括这种试剂在内的废物应作为危险化学品妥善处理。
