Le mauvais déroulement de rhodopsine cause la dégénérescence rétinienne progressive appelée pigmentosa de rétinite. Bien qu’une méthode d’imagerie traditionnelle aient une capacité limitée de quantifier le transport de rhodopsine, cet essai basé sur l’image nouvellement développé permet un criblage à haut débit, éliminant ainsi les faux positifs. Cette technique permet une évaluation rapide de la pharmacodynamique des médicaments.
Dans l’œil de sauver le pliage de la rhodopsine pathogène, accélérant ainsi le potentiel d’un traitement pour la maladie tranquillement incurable et aveuglante, la rétinite pigmentaire. La localisation cellulaire d’une protéine membranaire est très importante pour sa fonction. Cette méthode peut être facilement modifiée et appliquée pour quantifier le transport de toute autre protéine membranaire d’intérêt.
Assurez-vous de préparer une carte des plaques et d’ajouter et d’aspirer doucement le liquide de chaque puits de la plaque, afin de garder le numéro de cellule et les conditions d’état immuno compatibles entre les cellules. Cela donnera un facteur Z élevé, et des résultats fiables. Pour commencer, graine 5000 cellules par puits dans un fond noir muré, clair, poly lysine traitée 384-bien-plaque.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de CO2 pendant trois heures pour que les cellules se fixent au fond de la plaque. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 10 microlitres par puits de 5X solutions de travail, selon une carte de plaque prédéterminée comme celle montrée ici. Maintenant, ajoutez 10 microlitres par puits de 2%DMSO aux colonnes 22 et 24.
En outre, ajouter 10 microlitres par puits de 25 micromolaires 9-cis-rétiniens à la colonne 23 dans une pièce sombre sous une faible lumière rouge. Une fois terminé le chargement de tous les différents composés d’essai, couvrir la plaque avec du papier d’aluminium, et incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Sortez la plaque de 384 puits dans une pièce sombre avec une faible lumière rouge.
Ici, à l’aide de 8 canaux-aspirateur, connecté à une bouteille de collecte sous vide, pour aspirer doucement le milieu des puits de la plaque. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 20 microlitres par puits de paraformaldéhyde fraîchement préparé à l’ensemble de la plaque de 384 puits, et fixer les cellules pendant 20 minutes à température ambiante. Après fixation, placez la plaque dans la lumière normale.
Là, utilisez un aspirateur à 8 canaux, pour aspirer le paraformaldéhyde dans chaque puits, et utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres par puits de PBS. Aspirer et remplacer le PBS pour un total de trois cycles de lavage. Ensuite, ajouter 20 microlitres par puits de 5% sérum de chèvre à chaque puits, et incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes.
Après incubation, aspirer les puits, et ajouter 15 microlitres de 20 microgrammes par millilitre B630 anticorps anti-rhodopsine, en sérum de chèvre 1% aux puits dans les rangées A à O.Next, ajouter 15 microlitres par puits de 1% sérum de chèvre à la rangée P pour le groupe témoin secondaire anticorps seulement. Incuber la plaque à température ambiante pendant 90 minutes, ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, recouvrez la plaque de papier d’aluminium pour éviter le photobleaching des fluorophores.
Ensuite, lavez la plaque trois fois avec 50 microlitres par puits de PBS. Après le dernier lavage, aspirer le PBS, et ajouter 15 microlitres par puits de cinq microgrammes par millilitre d’anticorps IgG de chèvre conjugué Cy3. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et incuber les échantillons à température ambiante pendant une heure.
Après l’incubation, laver la plaque trois fois. Ajouter ensuite 50 microlitres par puits de PBS, contenant un microgramme par millilitre de tache Hoechst à température ambiante pendant 15 minutes. Enfin, sceller la plaque de puits avec un film transparent, la couvrir de papier d’aluminium et la conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine.
Retirez le papier d’aluminium et placez la plaque d’échantillon dans un imageur à haute teneur, avec A1 placé sur le coin supérieur gauche de la plaque. Ensuite, ouvrez le logiciel d’acquisition d’images pour configurer les paramètres d’acquisition d’images. Ouvrez la fenêtre d’installation d’acquisition de plaque et créez un nouveau paramètre ou chargez un fichier d’installation existant.
Sélectionnez l’objectif 20X et configurez le binning pixel comme deux, de sorte que la taille calibrée des pixels est de 0,80 par 0,80 microns. Ensuite, définissez les lignes d’analyse comme 2000, et la taille de l’image comme 1000 par 1000 pixels par site. Ensuite, sélectionnez le type de plaque à imager.
Utilisez les informations fournies par le fabricant pour remplir les dimensions de la plaque. Maintenant, sélectionnez les puits à imager avec quatre sites à image par puits. Évitez le côté du puits, qui sont touchés par les pointes d’aspiration.
Pour l’imagerie, sélectionnez des lasers à excitation comme 405, 488 et 461 nanomètres. Ensuite, sélectionnez les filtres d’émission pour les canaux DAPI, FITC et Texas Red. Optimisez la puissance laser et les gains de chaque canal, pour vous assurer que les puits de contrôle positifs ne sont pas saturés.
Sélectionnez bien pour bien se concentrer pour l’auto-focus. Ensuite, sélectionnez le puits initial à acquérir, et définissez le site auto-focus pour tous les sites. En outre, sélectionnez quatre moyennes par ligne pour chaque canal, et optimisez la valeur z-offset pour chaque canal.
Valider, que tout est correctement mis en place, en testant d’abord deux à trois puits aux coins de la plaque, pour s’assurer que les images sont au point pour tous les puits testés. Ensuite, vérifiez que les images de tous les sites par puits ont des cellules avec plus de 40% de confluence. Enfin, vérifiez que les intensités de fluorescence dans tous les canaux sont toutes à peu près à moitié saturées dans les puits de contrôle à 100 %.
Ensuite, enregistrez la méthode d’acquisition d’image et exécutez l’ensemble de la plaque. Regardez l’imageur jusqu’à ce qu’il fine la capture d’images à partir de la première colonne de la plaque pour vérifier la qualité de l’image avant de quitter l’imageur. Une fois terminée, retirez la plaque et rangez-la à quatre degrés Celsius pour une utilisation future.
Retirez les données d’image à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image à contenu élevé. Sélectionnez l’un des puits de contrôle à 100 % de la colonne 23 pour configurer les paramètres. Tout d’abord, sélectionnez la notation des cellules multi-longueurs d’onde comme méthode d’analyse, et commencez à configurer les paramètres supplémentaires.
Définissez les noyaux à l’aide d’images du canal DAPI. Aperçu, pour s’assurer que les formes de noyaux définis dans le puits sélectionné s’intègre bien avec les images noyaux. Ensuite, définissez la forme de la cellule dans le canal FITC, où Rhodopsin Vénus est photographiée.
Pour ce faire, configurer les diamètres minimum et maximum de chaque cellule, l’intensité minimale de fluorescence au-dessus de l’arrière-plan, ainsi que la zone minimale de chaque cellule. Maintenant, définissez les zones de tache de surface de cellules de rhodopsine dans le canal rouge du Texas, en installant les diamètres mini et maximum de forme de cellules, l’intensité de fluorescence de minium au-dessus du fond, aussi bien que la zone minimale de chaque cellule souillée. Testez l’algorithme actuel dans cinq puits pour déterminer si les paramètres sont optimisés.
Ensuite, enregistrez les paramètres et fermez la fenêtre de configuration. Exécutez tous les puits avec la méthode d’analyse optimisée. Une fois terminé, exportez le numéro d’objet comme numéro de cellule intact.
Exportez l’intensité moyenne du canal FITC comme intensité rhodopsine vénus, et exportez l’intensité moyenne du canal rouge du Texas sous forme d’intensité rhodopsine à la surface cellulaire. Utilisez le logiciel de feuille de calcul pour générer une carte thermique en deux couleurs pour chaque paramètre. Disposer le nom des lignes cellulaires sur l’axe x, et les composés sur l’axe Y.
Ici, nos images de P23H rhodopsine Vénus traité cellules U2OS, exprimant la fluorescence vénus en vert, et la surface cellulaire immuno-coloration en rouge. Les cellules ont été traitées avec DMSO ou cinq micromolaires 9-cis-rétiniens. L’analyse de transport de rhodopsine, comparant la quantité de rhodopsine dans la cellule entière dans diverses conditions, montre une récupération significative dans la ligne de cellule mutante de P23H, une fois traitée avec 9-cis-rétinien.
En outre, l’intensité de rhodopsine sur la surface de cellules, et le rapport de la tache de rhodopsine sur la surface de cellules à l’intensité de Vénus de rhodopsine dans la cellule entière, ne sont pas sensiblement inférieurs pour le mutant de P23H, comparé au rhodopsin sauvage traité avec DMSO. Une carte thermique est un moyen efficace de comparer la quantité moyenne de rhodopsine et la localisation par cellule à travers plusieurs mutants. Ici, les contrôles de wildtype et six mutants de rhodopsine sont énumérés horizontalement, et les effets des traitements composés sont comparés verticalement.
En accord avec les études précédentes, l’intensité de rhodopsine sur la surface de cellules et le rapport de la tache de rhodopsine sur la surface de cellules à l’intensité de Vénus de rhodopsine sont plus bas pour les six mutants comparés au type sauvage traité avec DMSO. Composés un, deux, six et neuf significativement augmenté le rapport de la tache de rhodopsine sur la surface cellulaire à l’intensité de Vénus rhodopsine dans T4R, P23H, D190N, et P267L mutants rhodopsine, suggérant que ces composés sauver le transport de ces mutants rhodopsine à la membrane plasmatique. Gardez à l’esprit que les cellules doivent être entre 50 et 70% confluent avant la fixation, car cela est essentiel pour l’analyse d’image.
En outre, nous avons montré des images d’un puits à travers toute la plaque. Assurez-vous, que les images au point, et que la fluorescence, qui ne sortent pas, ont toute la valeur seuil pour n’importe quel canal. Jusqu’à un composé de sélection, qui sauvent le transport malfolded de rhodopsine, nous pouvons valider le processus, puis passer l’efficacité de ces composés in vivo, utilisant un modèle de souris exprimant le mutant de P23H de rhodopsine.
Cette méthode nous permet de quantifier la quantité de protéines membranaires et sa localisation. Par conséquent, c’est un excellent outil pour la micro erreur commencée sur la protéine membranaire par aide enregistrer et la dégradation. Le paraformaldéhyde, comme c’est le cas dans cette expérience, a des procédures impliquant la manipulation de ce reagent.
Ce sera fait sous le capot. Les déchets, y compris ce reagent, doivent être éliminés correctement comme un produit chimique dangereux.
