هنا، نقدم بروتوكول لاستخدام الإيثانول كمذيب لاستخراج وتوصيف الدنجة الخضراء التايوانية التي تمنع النشاط المضاد للبكتيريا. هذا البروتوكول هو طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لتحديد نوعية البروبوليس الأخضر التايواني. الإجراء البرهاني سيكون تشون تينغ تشين ويهسنوان شين، طلاب الدكتوراه من مختبري.
للبدء، تزن بها 100 غرام من البروبوليس الأخضر التايواني. باستخدام طاحونة التوابل، طحن البروبوليس التأكد من أن القطع هي الأرض في مسحوق ناعم دون أي جزيئات كبيرة. حدد خمس قارورة وأضف 100 ملليلتر من تركيزات مختلفة من الإيثانول في الماء إلى كل منها.
اخلط 10 جرامات من البروبوليس الأرضي في محلول الإيثانول في كل قارورة، وحضن في درجة حرارة 25 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 48 ساعة. بعد ذلك، استخدم ورقة التصفية بحجم مسام 25 ميكرومتر لتصفية مستخلصات الإيثانول. باستخدام قارورة حجمية، إعادة تشكيل filtrates إلى حجمها الأصلي من 100 ملليلتر مع 95٪ الإيثانول.
تخزين المقتطفات المعاد تشكيلها في ناقص 20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. عندما تكون جاهزة لإعداد مقتطفات لHPLC، واستخدام تبخر فراغ لتركيز 10 ملليلتر من كل استخراج في 40 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. خبز المادة الجافة في 45 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
ثم، إعادة تشكيل كل عينة من المادة الجافة مع 10 ملليلتر من 95٪الإيثانول. باستخدام مرشح حقنة مع حجم المسام 0.22 ميكرومتر، refilter كل استخراج وجمع الترشيح للتحليل المباشر مع HPLC. للبدء في إنشاء منحنى قياسي، قم بإعداد لتر واحد من الميثانول المرحلة المتنقلة إلى محلول المياه بنسبة 88.8 إلى 11.2.
باستخدام حل المرحلة المتنقلة كمذيب، إعداد التخفيفات التسلسلية من تركيزات البروبيلين القياسية على النحو المبين في بروتوكول النص. اِنْفِن 20 ميكرولترات من كل تركيز معياري في أعمدة المرحلة العكسية بشكل متتابع من أدنى تركيز إلى أعلى. ثم، تعيين العمود HPLC إلى 30 درجة مئوية، تعيين طول التنازل عن كاشف الأشعة فوق البنفسجية إلى 280 نانومتر، ومعدل التدفق إلى ملليلتر واحد في الدقيقة الواحدة، ووقت مسجل إلى 20 دقيقة.
تحليل المعايير ثلاث مرات على الأقل. بعد ذلك، استخدم برنامج ورقة الحساب لتوصيل استجابة القياس مقابل التركيز الناتج عن منحنى قياسي مع معادلة محددة وقيمة R-تربيع. للبدء في تحليل مقتطفات، حقن 20 ميكرولترات من كل استخراج في العمود المرحلة العكسية.
تعيين العمود HPLC إلى درجة حرارة 30 درجة مئوية، ومعدل تدفق من ملليلتر واحد في الدقيقة. تعيين مدة التنازل عن كاشف الأشعة فوق البنفسجية إلى 280 نانومتر، ووقت مسجل إلى 20 دقيقة. تحليل مقتطفات ثلاث مرات على الأقل.
ثم، استخدم المنحنى القياسي لتحديد تركيز البروبيلين في كل مستخلص الإيثانول. بعد إعداد الكائنات الحية الاختبارية ومستخلصات الإيثانول، أضف 10 ميكرولترات من مستخلص الإيثانول المخفف، تتراوح بين 0.156 إلى 640 ميكروغرام لكل ملليلتر في آبار لوحة 96 بئر. استخدام مرق لضبط حجم في كل بئر إلى 100 ميكرولتررز التأكد من الحفاظ على 5٪ DMSO في جميع التخفيفات.
بعد ذلك ، تلقيح 100 ميكرولترات من الثقافة البكتيرية في كل بئر من 96 بئر. الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. استخدام قارئ microplate في 590 نانومتر لتحليل النمو البكتيري وفقا لالتكدر ولتحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط.
بعد هذا، تلقيح 10 ميكرولترات من الثقافة السائلة من كل بئر التي أظهرت للنمو على لوحة أجار. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تحديد أدنى تركيز التي كشفت عن عدم وجود نمو البكتيرية مرئية لتحديد النشاط البكتيري.
ويعتبر التركيز الذي قضى تماما نمو الخلايا ليكون الحد الأدنى تركيز البكتيريا. في هذه الدراسة، يتم استخراج البروبوليس الأخضر التايواني مع الإيثانول. ويبدو أن غلة المادة الجافة تكون أعلى عندما يتم استخدام تركيز عال من الإيثانول، وأقل عندما يتم استخدام المياه.
وتشير هذه النتائج إلى أن المذيب العضوي يؤدي أفضل خلال هذا الاستخراج، وأن العائد يرتبط إيجابيا مع تركيز الإيثانول. وبالمثل، يبدو أن تركيز البروبولينات يرتبط بشكل إيجابي بتركيز الإيثانول أثناء الاستخراج، مع الحصول على أعلى عائد من البروبولين في مستخلصات الإيثانول 95٪و 99.5٪. ثم يتم التحقيق في الآثار المضادة للبكتيريا من مستخلصات الإيثانول ضد Aureus S والإشريكية القولونية.
ويبدو أن متوسط الحد الأدنى للتركيز المثبط لـ S aureus يتراوح بين 10 و20 ميكروغرامًا لكل ملليلتر، ويبدو أن متوسط التركيز البكتيري هو 20 ميكروغرامًا لكل ملليلتر. ومع ذلك، لم يكن لدى مستخلصات الماء أي تأثير مضاد للبكتيريا ضد S aureus. لا يلاحظ أي تأثير مضاد للبكتيريا لـ E coli عند استخدام إما مستخلصات الماء أو الإيثانول.
واحدة من الإجراءات التجريبية الرئيسية هو تجنب توحيد البروبوليس الأخضر التايوانية أثناء الطحن.
