Aqui, apresentamos o protocolo para o uso do etanol como solvente para extrair e caracterizar própolis verde taiwanesa que inibe a atividade antibacteriana. Este protocolo é um método confiável e repetível para determinar a qualidade da própolis verde taiwanesa. O procedimento de demonstração será Chun'Ting Chen e Yi'Hsuan Chien, doutorandos do meu laboratório.
Para começar, pese 100 gramas de própolis verde taiwanesa. Usando um moedor de especiarias, triture a própolis certificando-se de que os pedaços são moídas em um pó fino sem partículas grandes. Coloque cinco frascos e adicione 100 mililitros de várias concentrações de etanol na água para cada um.
Misture 10 gramas de própolis moída na solução de etanol em cada frasco, e incubar a 25 graus Celsius com agitação a 250 RPM por 48 horas. Depois disso, use papel filtro com um tamanho de poros de 25 micrômetros para filtrar os extratos de etanol. Usando um frasco volumoso, reconstitua os filtrados ao seu volume original de 100 mililitros com 95% de etanol.
Armazene os extratos reconstituídos a menos 20 graus Celsius até que estejam prontos para uso. Quando estiver pronto para preparar os extratos para HPLC, use a evaporação do vácuo para concentrar 10 mililitros de cada extrato a 40 graus Celsius por 10 minutos. Asse a matéria seca a 45 graus Celsius por 24 horas.
Em seguida, reconstituir cada amostra de matéria seca com 10 mililitros de 95% de etanol. Utilizando um filtro de seringa com um tamanho de poros de 0,22 micrômetros, refiltre cada extrato e colete o filtrado para análise direta com o HPLC. Para começar a estabelecer uma curva padrão, prepare um litro da solução de metanol de fase móvel para água em uma proporção de 88,8 a 11,2.
Usando a solução de fase móvel como solvente, prepare diluições seriais das concentrações padrão propolin, conforme descrito no protocolo de texto. Injete 20 microliters de cada concentração padrão nas colunas de fase inversa sequencialmente da menor concentração para a mais alta. Em seguida, defina a coluna HPLC para 30 graus Celsius, defina o comprimento de renúncia do detector UV para 280 nanômetros, e a taxa de fluxo para um mililitro por minuto, e o tempo do gravador para 20 minutos.
Analise os padrões pelo menos três vezes. Depois disso, use o software da folha de cálculo para conectar a resposta de medição contra a concentração resultando em uma curva padrão com uma equação determinada e valor R-quadrado. Para começar a analisar os extratos, injete 20 microliters de cada extrato na coluna de fase inversa.
Defina a coluna HPLC a uma temperatura de 30 graus Celsius, e uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Defina o comprimento do detector UV para 280 nanômetros, e o tempo do gravador para 20 minutos. Analise os extratos pelo menos três vezes.
Em seguida, use a curva padrão para determinar a concentração de propolin em cada extrato de etanol. Após a preparação dos organismos de teste e extratos de etanol, adicione 10 microlitadores de extrato de etanol diluído, variando de 0,156 a 640 microgramas por mililitro nos poços de uma placa de poço de 96. Use caldo para ajustar o volume em cada poço para 100 microliters, certificando-se de manter 5% DMSO em todas as diluições.
Em seguida, inocular 100 microliters de cultura bacteriana em cada poço da placa 96. Cultura a 37 graus Celsius por 48 horas. Use um leitor de microplacos a 590 nanômetros para analisar o crescimento bacteriano de acordo com a turbidez e determinar a concentração inibitória mínima.
Depois disso, inocular 10 microliters de cultura líquida de cada poço que exibiu crescimento em uma placa de ágar. Incubar a 37 graus Celsius por 24 horas. Identifique a menor concentração que não revelou crescimento bacteriano visível para determinar a atividade bacteriana.
A concentração que eliminou completamente o crescimento celular é considerada a concentração bacteriana mínima. Neste estudo, a própolis verde taiwanesa é extraída com etanol. O rendimento da matéria seca parece ser mais alto quando uma alta concentração de etanol é usada, e menor quando a água é usada.
Esses resultados indicam que um solvente orgânico tem melhor desempenho durante essa extração, e que o rendimento está positivamente associado à concentração de etanol. Da mesma forma, a concentração de propolins parece estar positivamente associada à concentração de etanol durante a extração, com o maior rendimento de propolins sendo obtido nos extratos de 95% e 99,5% de etanol. Os efeitos antibacterianos dos extratos de etanol contra o Aureus S e e coli são então investigados.
A concentração mínima média inibitória para S aureus parece estar entre 10 e 20 microgramas por mililitro e a concentração bacteriana média parece ser de 20 microgramas por mililitro. Os extratos de água, no entanto, não apresentaram nenhum efeito antibacteriano contra s aureus. Nenhum efeito antibacteriano é observado para E coli ao usar os extratos de água ou etanol.
Um dos principais procedimentos experimentais é evitar a uniformidade da própolis verde taiwanesa durante a moagem.
