여기서, 항균 활성을 억제하는 대만 녹색 프로폴리스를 추출하고 특성화하기 위해 용매로서 에탄올을 사용하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 대만 녹색 프로폴리스의 품질을 결정하는 신뢰할 수 있고 반복 가능한 방법입니다. 시범 절차는 춘팅 첸과 이수안 치엔 박사 과정 학생이 될 것입니다.
우선, 무게 100 대만 녹색 프로폴리스의 그램. 향신료 분쇄기를 사용하여 프로폴리스를 갈아서 큰 입자가없는 미세 분말로 분쇄되도록하십시오. 5개의 플라스크를 설정하고 각각 물에 에탄올의 다양한 농도의 100 밀리리터를 추가합니다.
각 플라스크에서 10그램의 지상 프로폴리스를 에탄올 용액에 넣고 섭씨 25도에서 48시간 동안 250RPM에서 흔들어 서 배양합니다. 그 후 25마이크로미터 모공 크기의 필터 용지를 사용하여 에탄올 추출물을 필터링합니다. 볼륨 플라스크를 사용하여, 95 %의 에탄올과 100 밀리리터의 원래 볼륨으로 여과를 재구성.
재구성된 추출물을 사용 준비가 될 때까지 영하 20도에 보관하십시오. HPLC용 추출물을 준비할 준비가 되면 진공 증발을 사용하여 각 추출물의 10밀리리터를 섭씨 40도에서 10분 동안 농축합니다. 건조 물질을 섭씨 45도에서 24시간 동안 굽습니다.
그런 다음, 95%에탄올의 10 밀리리터로 건조 물질의 각 샘플을 재구성합니다. 0.22 마이크로미터 모공 크기의 주사기 필터를 사용하여 각 추출물을 다시 필터링하고 HPLC를 사용하여 직접 분석을 위해 여과물을 수집합니다. 표준 곡선 을 확립하기 시작하려면 88.8 에서 11.2의 비율로 이동 상 메탄올의 1 리터를 물 용액에 준비하십시오.
모바일 위상 솔루션을 용매로 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 프로폴린 표준 농도의 직렬 희석을 준비합니다. 각 표준 농도의 20 마이크로리터를 가장 낮은 농도에서 최고수준으로 순차적으로 역상 컬럼에 주입한다. 그런 다음 HPLC 컬럼을 섭씨 30도로 설정하고 UV 검출기의 면제 길이를 280나노미터로 설정하고 유량은 분당 1밀리리터로 설정하고 레코더 시간을 20분으로 설정합니다.
표준을 세 번 이상 분석합니다. 그런 다음 계산 시트 소프트웨어를 사용하여 측정 응답을 농도에 연결하여 결정된 방정식 및 R 제곱 값으로 표준 곡선을 생성합니다. 추출물 분석을 시작하려면 각 추출물의 20마이크로리터를 역상 열에 주입합니다.
HPLC 열을 섭씨 30도의 온도와 분당 1밀리리터의 유량으로 설정합니다. UV 검출기의 면제 길이를 280나노미터로 설정하고 레코더 시간을 20분으로 설정합니다. 추출물을 적어도 세 번 분석합니다.
이어서, 표준 곡선을 사용하여 각 에탄올 추출물에서 프로폴린의 농도를 결정한다. 시험 유기체 및 에탄올 추출물을 준비한 후, 희석 된 에탄올 추출물 10 마이크로 리터를 96 웰 플레이트의 우물에 밀리리터 당 0.156에서 640 마이크로 그램에 넣습니다. 국물을 사용하여 각 웰의 볼륨을 100 마이크로리터로 조정하여 모든 희석제에서 5%DMSO를 유지관리합니다.
다음으로, 96 웰 플레이트의 각 우물에 세균 배양의 100 마이크로리터를 접종. 48시간 동안 섭씨 37도에서 문화. 590 나노미터에서 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 탁도에 따라 세균 성장을 분석하고 최소 억제 농도를 결정합니다.
그 후, 각 우물에서 액체 배양의 10 마이크로 리터를 접종한 후, 한천 판에 성장을 나타냈다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하세요. 세균 활성을 결정하기 위해 눈에 보이는 세균 성 성장이 없음을 밝힌 가장 낮은 농도를 식별합니다.
세포 성장을 완전히 제거한 농도는 최소 세균 농도로 간주됩니다. 이 연구에서, 대만 녹색 프로폴리스는 에탄올로 추출됩니다. 건조 물질 수율은 에탄올의 고농도를 사용할 때 가장 높은 것 같다, 물을 사용할 때 가장 낮은.
이러한 결과는 유기 용매가 이 추출 중에 가장 잘 수행되고, 수율이 에탄올 농도와 긍정적으로 연관되어 있음을 나타낸다. 마찬가지로, 프로폴린의 농도는 추출 시 에탄올 농도와 긍정적으로 연관된 것으로 보이며, 95%와 99.5%의 에탄올 추출물에서 얻을 수 있는 프로폴린의 가장 높은 수율이다. S 아우레우스와 대장균에 대한 에탄올 추출물의 항균 영향은 조사됩니다.
S 아우레우스에 대한 평균 최소 억제 농도는 밀리리터 당 10~20마이크로그램으로 보이며 평균 세균 농도는 밀리리터당 20마이크로그램인 것으로 보인다. 그러나 물 추출물은 S 아우레우스에 대한 항균 영향을 미치지 않았습니다. 물 또는 에탄올 추출물을 사용할 때 대장균에 대한 항균 영향은 관찰되지 않습니다.
주요 실험 절차 중 하나는 연마 하는 동안 대만 녹색 propolis의 균일성을 피하는 것입니다.
