Здесь мы представляем протокол использования этанола в качестве растворителя для извлечения и характеристики тайваньского зеленого прополиса, который подавляет антибактериальную активность. Этот протокол является надежным и повторяемым методом для определения качества тайваньского зеленого прополиса. Демонстрация процедуры будет Chun'Ting Чэнь и Yi'Hsuan Chien, аспирантов из моей лаборатории.
Для начала взвесить 100 граммов тайваньского зеленого прополиса. Используя мясорубку специй, измельчить прополис убедившись, что куски измельчаются в мелкий порошок без каких-либо крупных частиц. Установите пять колб и добавить 100 миллилитров различных концентраций этанола в воде к каждому.
Смешайте 10 граммов молотого прополиса в раствор этанола в каждой колбе и инкубировать при 25 градусах по Цельсию при встряхивании при 250 об/мин в течение 48 часов. После этого используйте фильтровальную бумагу размером 25 микрометров для фильтрации экстрактов этанола. Используя объемную колбу, воссоздайте фильтраты до их первоначального объема в 100 миллилитров с 95%этанолом.
Храните восстановленные экстракты при температуре минус 20 градусов по Цельсию до готовности к использованию. Когда готовы подготовить экстракты для HPLC, использовать вакуумное испарение, чтобы сконцентрировать 10 миллилитров каждого экстракта при 40 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Выпекать сухое вещество при температуре 45 градусов по Цельсию в течение 24 часов.
Затем, восстановить каждый образец сухого вещества с 10 миллилитров 95% этанола. Используя шприц-фильтр с размером поры 0,22 микрометра, перефильтруйте каждый экстракт и соберите фильтрат для прямого анализа с помощью HPLC. Чтобы начать создание стандартной кривой, подготовь один литр мобильного фазового метанола к водному раствору в соотношении 88,8 к 11,2.
Используя решение мобильной фазы в качестве растворителя, подготовьте серийные разбавления стандартных концентраций продолина, как указано в текстовом протоколе. Впрыснуть 20 микролитров каждой стандартной концентрации в обратные фазные столбцы последовательно от самой низкой концентрации до самой высокой. Затем установите столбец HPLC до 30 градусов по Цельсию, установите длину УФ-детектора до 280 нанометров, а скорость потока до одного миллилитра в минуту, а время диктофона до 20 минут.
Проанализируйте стандарты не менее трех раз. После этого используйте программное обеспечение для расчета листа, чтобы подключить ответ измерения против концентрации, в результате чего стандартная кривая с определяемой уравнением и значением R-квадрата. Чтобы начать анализ экстрактов, ввимите 20 микролитров каждого экстракта в обратный фазовой столбец.
Установите столбец HPLC до температуры 30 градусов по Цельсию и скорости потока в миллилитр в минуту. Установите длину УФ-детектора до 280 нанометров, а время диктофона до 20 минут. Проанализируйте экстракты не менее трех раз.
Затем используйте стандартную кривую для определения концентрации продолина в каждом экстракте этанола. После подготовки испытательных организмов и экстрактов этанола добавьте 10 микролитров экстракта разбавленного этанола в диапазоне от 0,156 до 640 микрограммов на миллилитр в скважины пластины 96 скважин. Используйте бульон, чтобы настроить объем в каждой хорошо до 100 микролитров убедившись, что для поддержания 5%DMSO во всех разбавления.
Далее, привить 100 микролитров бактериальной культуры в каждом колодец из 96 хорошо пластины. Культура при 37 градусах по Цельсию в течение 48 часов. Используйте считыватель микроплатформ на 590 нанометров для анализа роста бактерий в зависимости от мутности и определения минимальной концентрации ингибиторов.
После этого, привить 10 микролитров жидкой культуры из каждой хорошо, что выставлены для роста на агар пластины. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. Определите самую низкую концентрацию, которая не выявила видимого роста бактерий для определения бактериальной активности.
Концентрация, полностью исключиваемая рост клеток, считается минимальной бактериальной концентрацией. В этом исследовании тайваньский зеленый прополис добывается с этанолом. Урожайность сухого вещества, как представляется, является самой высокой при использовании высокой концентрации этанола и самой низкой при использовании воды.
Эти результаты показывают, что органический растворитель работает лучше всего во время этой экстракции, и что урожайность положительно связана с концентрацией этанола. Аналогичным образом, концентрация прополинов, как представляется, положительно связаны с концентрацией этанола во время извлечения, с самым высоким выходом продолиных полученных в 95% и 99,5% этанола экстрактов. Антибактериальное влияет на экстракты этанола против S aureus и кишечной палочки затем исследованы.
Средняя минимальная ингибирующая концентрация S aureus, как представляется, составляет от 10 до 20 микрограмм на миллилитр и средняя бактериальная концентрация, как представляется, 20 микрограмм на миллилитр. Экстракты воды, однако, не имеют никакого антибактериального влияния против S aureus. Никакое антибактериальное воздействие не наблюдается для кишечной палочки при использовании либо воды или этанола экстрактов.
Одной из ключевых экспериментальных процедур является отказ от единообразия тайваньского зеленого прополиса во время измельчения.
