Aquí, presentamos el protocolo para el uso de etanol como disolvente para extraer y caracterizar el propóleo verde taiwanés que inhibe la actividad antibacteriana. Este protocolo es un método fiable y repetible para determinar la calidad del propóleo verde taiwanés. El procedimiento de demostración será Chun'Ting Chen y Yi'Hsuan Chien, estudiantes de doctorado de mi laboratorio.
Para empezar, pesa 100 gramos de propóleos verdes taiwaneses. Usando un molinillo de especias, muele el propóleo asegurándose de que las piezas estén molidas en un polvo fino sin partículas grandes. Establecer cinco matraces y añadir 100 mililitros de diversas concentraciones de etanol en agua a cada uno.
Mezclar 10 gramos de propóleo molido en la solución de etanol en cada matraz, e incubar a 25 grados centígrados con agitación a 250 RPM durante 48 horas. Después de esto, utilice papel de filtro con un tamaño de poro de 25 micrómetros para filtrar los extractos de etanol. Con un matraz volumétrico, reconstituya los filtrados a su volumen original de 100 mililitros con 95% de etanol.
Almacene los extractos reconstituidos a menos 20 grados centígrados hasta que estén listos para su uso. Cuando esté listo para preparar los extractos para HPLC, utilice la evaporación al vacío para concentrar 10 mililitros de cada extracto a 40 grados Celsius durante 10 minutos. Hornee la materia seca a 45 grados centígrados durante 24 horas.
A continuación, reconstituir cada muestra de materia seca con 10 mililitros de 95%etanol. Usando un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,22 micrómetros, vuelva a filtrar cada extracto y recoja el filtrado para su análisis directo con HPLC. Para comenzar a establecer una curva estándar, prepare un litro de la solución móvil de metanol a agua en una proporción de 88,8 a 11,2.
Utilizando la solución de fase móvil como disolvente, prepare diluciones en serie de las concentraciones estándar de propon, tal como se describe en el protocolo de texto. Inyectar 20 microlitros de cada concentración estándar en las columnas de fase inversa secuencialmente desde la concentración más baja hasta la más alta. A continuación, establezca la columna HPLC en 30 grados Celsius, establezca la longitud de renuncia del detector UV en 280 nanómetros, y el caudal en un mililitro por minuto, y el tiempo de grabación en 20 minutos.
Analice las normas al menos tres veces. Después de esto, utilice el software de hoja de cálculo para conectar la respuesta de medición contra la concentración, lo que resulta en una curva estándar con una ecuación determinada y un valor R cuadrado. Para comenzar a analizar los extractos, inyecte 20 microlitros de cada extracto en la columna de fase inversa.
Establezca la columna HPLC a una temperatura de 30 grados centígrados y un caudal de un mililitro por minuto. Establezca la longitud de renuncia del detector UV en 280 nanómetros y el tiempo de grabación en 20 minutos. Analice los extractos al menos tres veces.
A continuación, utilice la curva estándar para determinar la concentración de proponina en cada extracto de etanol. Después de preparar los organismos de ensayo y los extractos de etanol, añadir 10 microlitros de extracto de etanol diluido, que van desde 0.156 a 640 microgramos por mililitro en los pozos de una placa de 96 pozos. Utilice caldo para ajustar el volumen de cada pocero a 100 microlitros asegurándose de mantener 5%DMSO en todas las diluciones.
A continuación, inocular 100 microlitros de cultivo bacteriano en cada pozo de la placa de 96 pozos. Cultura a 37 grados centígrados durante 48 horas. Utilice un lector de microplacas a 590 nanómetros para analizar el crecimiento bacteriano de acuerdo con la turbidez y para determinar la concentración inhibitorina mínima.
Después de esto, inocular 10 microlitros de cultivo líquido de cada pozo que exhibieron para crecer en una placa de agar. Incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Identificar la concentración más baja que no reveló crecimiento bacteriano visible para determinar la actividad bacteriana.
La concentración que eliminó completamente el crecimiento celular se considera la concentración bacteriana mínima. En este estudio, el propóleo verde taiwanés se extrae con etanol. El rendimiento de materia seca parece ser más alto cuando se utiliza una alta concentración de etanol, y más bajo cuando se utiliza agua.
Estos resultados indican que un disolvente orgánico funciona mejor durante esta extracción, y que el rendimiento se asocia positivamente con la concentración de etanol. Del mismo modo, la concentración de propons se parece estar positivamente asociada con la concentración de etanol durante la extracción, con el mayor rendimiento de propolinas que se obtiene en los extractos de etanol 95% y 99,5%. A continuación se investigan los efectos antibacterianos de los extractos de etanol contra el Aureus y la coli.
La concentración inhibitoria mínima media de S aureus parece estar entre 10 y 20 microgramos por mililitro y la concentración bacteriana media parece ser de 20 microgramos por mililitro. Los extractos de agua, sin embargo, no tenían ningún efecto antibacteriano contra S aureus. No se observa ningún efecto antibacteriano para E coli cuando se utiliza el agua o extractos de etanol.
Uno de los procedimientos experimentales clave es evitar la uniformidad del propóleo verde taiwanés durante la molienda.
