כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול לשימוש באתנול כממס כדי לחלץ ולאפיין פרופוליס ירוק טייוואני המעכב פעילות אנטיבקטריאלית. פרוטוקול זה הוא שיטה אמינה וחוזרת על עצמה לקביעת האיכות של פרופוליס ירוק טייוואני. הליך ההדגמה יהיה צ'ונינג צ'ן ו Yi'Hsuan Chien, דוקטורנטים מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, לשקול 100 גרם של פרופוליס ירוק טייוואני. בעזרת מטחנת תבלינים, טוחנים את הפרופוליס ומוודאים שהחתיכות טחונות לאבקה דקה ללא חלקיקים גדולים. מניחים חמישה בקבוקונים ומוסיפים 100 מיליליטר של ריכוזים שונים של אתנול במים לכל אחד מהם.
מערבבים 10 גרם של פרופוליס הקרקע לתוך פתרון אתנול בכל בקבוק, ו דגירה ב 25 מעלות צלזיוס עם רועד ב 250 סל"ד במשך 48 שעות. לאחר מכן, השתמש בנייר סינון עם גודל נקבובית 25 מיקרומטר כדי לסנן את תמציות האתנול. באמצעות בקבוקון נפחי, מחדש את filtrates לנפח המקורי שלהם של 100 מיליליטר עם 95%אתנול.
לאחסן את התמציות מחדש במינוס 20 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. כאשר מוכן להכין את התמציות עבור HPLC, להשתמש אידוי ואקום לרכז 10 מיליליטר של כל תמצית ב 40 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אופים את החומר היבש ב 45 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
לאחר מכן, מחדש כל מדגם של חומר יבש עם 10 מיליליטר של 95% אתנול. באמצעות מסנן מזרק עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר, לסנן מחדש כל תמצית ולאסוף את הסינון לניתוח ישיר עם HPLC. כדי להתחיל בהקמת עקומה סטנדרטית, הכינו ליטר אחד של מתנול השלב הנייד לפתרון מים ביחס של 88.8 עד 11.2.
באמצעות פתרון הפאזה הנייד כממס, הכן דילול סדרתי של הריכוזים הסטנדרטיים של הפרופולין כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הזרק 20 מיקרוליטרים של כל ריכוז סטנדרטי לעמודי הפאזה ההפוכים ברצף מהריכוז הנמוך ביותר לגבוה ביותר. לאחר מכן, הגדר את עמודת HPLC ל- 30 מעלות צלזיוס, הגדר את אורך ההיוותר של גלאי ה- UV ל- 280 ננומטר, ואת קצב הזרימה למיליליטר אחד לדקה, ואת זמן המקליט ל- 20 דקות.
לנתח את הסטנדרטים לפחות שלוש פעמים. לאחר מכן, השתמש בתוכנת גליון חישוב כדי לחבר את תגובת המדידה כנגד הריכוז וכתוצאה מכך עקומה סטנדרטית עם משוואה נחושה וערך R בריבוע. כדי להתחיל לנתח את התמציות, להזריק 20 microliters של כל תמצית לתוך עמודת הפאזה ההפוכה.
הגדר את עמודת HPLC לטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס וקצב זרימה של מיליליטר לדקה. הגדר את אורך ה-UV של גלאי ה-UV ל-280 ננומטר, ואת זמן המקליט ל-20 דקות. לנתח את התמציות לפחות שלוש פעמים.
לאחר מכן, להשתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לקבוע את הריכוז של פרופולין בכל תמצית אתנול. לאחר הכנת אורגניזמים הבדיקה ותמציות אתנול, להוסיף 10 microliters של תמצית אתנול מדולל, החל 0.156 כדי 640 מיקרוגרם למיליליטר לתוך הבאר של צלחת 96 גם. השתמש במרק כדי לכוונן את עוצמת הקול בכל באר ל-100 מיקרוליטרים כדי לשמור על 5%DMSO בכל הדילולים.
לאחר מכן, לחסן 100 microliters של תרבות חיידקית לתוך כל באר של צלחת 96 היטב. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. השתמש בקורא מיקרופלסטיק ב 590 ננומטר כדי לנתח את הצמיחה החיידקית על פי מערבולת ולקבוע את הריכוז המעכב המינימלי.
לאחר מכן, לחסן 10 microliters של תרבות נוזלית מכל באר שהפגינו לצמיחה על צלחת אגר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. זהה את הריכוז הנמוך ביותר שלא חשף צמיחה חיידקית נראית לעין כדי לקבוע את פעילות החיידקים.
הריכוז שחיסל לחלוטין את צמיחת התאים נחשב לריכוז החיידקים המינימלי. במחקר זה, פרופוליס ירוק טייוואני מופק עם אתנול. תפוקת החומר היבש נראית הגבוהה ביותר כאשר נעשה שימוש בריכוז גבוה של אתנול, והנמוך ביותר כאשר נעשה שימוש במים.
תוצאות אלה מצביעות על כך ממס אורגני מבצע בצורה הטובה ביותר במהלך מיצוי זה, כי התשואה קשורה באופן חיובי עם ריכוז אתנול. כמו כן, נראה כי ריכוז הפרופולנים קשור באופן חיובי לריכוז האתנול במהלך החילוץ, כאשר התשואה הגבוהה ביותר של פרופולנים מתקבלת בתמציות האתנול 95%ו-99.5%. ההשפעות האנטיבקטריאליות של תמציות האתנול נגד Aureus S ו- E coli נחקרים לאחר מכן.
הריכוז המעכב המינימלי הממוצע עבור S aureus הוא נראה בין 10 ל 20 מיקרוגרם למיליליטר ואת הריכוז החיידקי הממוצע הוא נראה 20 מיקרוגרם למיליליטר. תמציות מים, עם זאת, לא היה כל השפעה אנטיבקטריאלית נגד S aureus. אין השפעה אנטיבקטריאלית נצפתה עבור E coli בעת שימוש או תמציות מים או אתנול.
אחד ההליך הניסיוני העיקרי הוא היסחפות האחידות של פרופוליס ירוק טייוואני במהלך שחיקה.
