يهدف هذا البروتوكول إلى عزل وتنقية الحويصلات الخلالية خارج الخلية للعضلات الهيكلية في أنسجة عضلات القوارض. ستوفر هذه الحويصلة خارج الخلية رؤى لا تقدر بثمن حول آلية مرض الحالة البشرية للعضلات مع إمكانية التطبيق كمؤشرات حيوية تشخيصية ومركبات علاجية. سيمكن هذا البروتوكول الموحد من تحليل ومقارنة خصائص العضلات الهيكلية المشتقة من EV عبر عينات العضلات المختلفة ، بما في ذلك العائد والحجم وتكوين الحمولة والوظيفة.
ستعزز هذه النتائج فهمنا لأدوارها في مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية ، كما ستسهل تطبيق هذه المركبات الكهربائية كمؤشرات حيوية تشخيصية. سيركز مختبرنا على إنتاج حويصلات خلالية للعضلات الهيكلية عالية النقاء وعالية الغلة بطريقة فعالة وفعالة من حيث الوقت. نهدف إلى استكشاف دورها المرضي وإمكاناتها العلاجية ، لا سيما في سياق الاضطرابات العصبية العضلية.
للبدء ، قم بتأمين ساق الفأر القتل الرحيم في صفيحة معقمة بحيث يكون الجانب الأمامي من الساق متجها لأعلى. باستخدام مقص التشريح ، قم بعمل شق صغير بطول خمسة ملليمترات في الجلد على الجانب الجانبي من كاحل الفأر. أدخل شفرة واحدة من المقص في الشق ، وضعها تحت الجلد ، ولكن فوق الأنسجة العضلية.
ثم قم بقص الجلد لأعلى باتجاه الركبة لتمديد الشق. استخدم ملاقط خشنة للإمساك بالجلد على طول الشق وسحبه للخلف لتوسيع الفتحة ، حتى تصبح العضلة مرئية. الآن ، حدد موقع عضلة الظنبوب الأمامية ، أو العضلة TA ، التي تمتد من الركبة إلى الكاحل ، على طول الجانب الجانبي من عظم الظنبوب.
استخدم ملاقط حادة للإمساك بالنسيج الضام الذي يغطي عضلة TA وتقشيرها بعناية. بالقرب من الكاحل ، حدد وتر TA المتصل بعضلة TA ووتر EDL الأصغر ، الموجود بجوار وتر TA على الجانب الجانبي. استخدم مقص التشريح لقطع كلا الأوتار.
استخدم ملاقط خشنة للاستيلاء على كلا الأوتار. باستخدام زوج آخر من الملقط ، افصل الأوتار بعناية ، وعزل TA عن EDL. بعد ذلك ، ارفع عضلة TA بواسطة الوتر المقطوع حديثا باستخدام ملاقط خشنة.
استخدم مقص التشريح لقطع وتر TA بالقرب من الركبة ، وإزالة العضلات. الآن ، حرر الساق واقلب الماوس بحيث يكون الجانب الخلفي من الساق متجها لأعلى. مع إزالة جزء من الجلد بالفعل ، استخدم مقص التشريح لقطع الجلد المتبقي بالقرب من الكاحل.
أمسك الجلد المقطوع بملاقط خشنة وقشره لأعلى باتجاه الجزء الخلفي من الركبة ، مما يؤدي إلى تعريض عضلة المعدة. استخدم مقص التشريح لقطع وتر المعدة بالقرب من الكاحل. أمسك وتر المعدة بملاقط خشنة وارفعه لأعلى لكشف الجانب السفلي من عضلة المعدة.
بعد ذلك ، حدد موقع وتر النعل الأصغر أسفل المعدة ، بالقرب من الركبة ، حيث لا يزال المعدة متصلا. استخدم مقص التشريح لقطع وتر النعل ، مما يسمح لعضلة النعل بالتقلص لأعلى. أمسك وتر النعل المقطوع بملاقط حادة وارفعه برفق لفصل العضلة الوحيدة عن الجانب السفلي من المعدة العصيبية.
استخدم مقص التشريح لقطع نهاية النعل ، حيث يعلق على الطرف المقطوع للمعدة ، ويفصل العضلات تماما. باستخدام مقص التشريح ، قم بقص نهاية المعدة بالقرب من الركبة وضعها في PBS على الجليد. بعد إزالة العضلات الأربع أسفل الركبة ، اقلب الماوس بحيث يكون الجانب الأمامي متجها لأعلى.
ضع ساق الماوس بزاوية 90 درجة لإجبار عضلة الفخذ على الانثناء. استخدم مقص التشريح لقطع الوتر الأقرب إلى الركبة. بعد ذلك ، لفصل عضلات الفخذ عن عظم الفخذ ، اقطع بين العضلة والعظام حتى يظل الوتر القريب فقط متصلا.
قطع الوتر القريب باستخدام مقص التشريح ، وإزالة عضلات الفخذ. اشطف جميع العضلات التي تمت إزالتها عدة مرات باستخدام PBS لإزالة الملوثات مثل الفراء والدم. جفف العضلات برفق باستخدام مناشف ورقية.
ابدأ بإزالة الأوتار برفق من عينة العضلات باستخدام ملاقط حادة أو ملاقط منشقة أو مشارط أو مقص. ثم ، باستخدام مقص أو مشرط ، قم بقطع العضلات طوليا على طول ألياف العضلات من وتر إلى آخر ، إلى قطع بسمك ملليمتر واحد. لتحضير المخزن المؤقت للإنزيم الهضمي ، اخلطي ملليغرامين من الكولاجيناز ، إنزيمين لكل مليلتر من DMEM مع محلول ستربتومايسين بنسلين 1٪.
بعد الخلط ، قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. افصل الأنسجة العضلية إلى أجزاء ، يحتوي كل منها على 20 ملليغرام من العضلات. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت المحضر إلى كل حصة للتفكك الأنزيمي واحتضانه.
قم بإعداد وتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة سعة 1.5 مل. قم بإعداد مرشح 0.45 ميكرومتر عن طريق إزالة المكبس من حقنة سعة خمسة ملليلتر. قم بربط محور الحقنة في الطرف العلوي من المرشح 0.45 ميكرومتر وضع الطرف السفلي من المرشح في أنبوب طرد مركزي دقيق يحمل علامة تجارية.
ثم, الطرد المركزي الخليط لمدة 10 دقائق عند 1000 جم وأربع درجات مئوية إلى حطام الحبيبات. استخدم ماصة دقيقة P-200 لنقل المادة الطافية إلى المحقنة. بعد إعادة إدخال المكبس في المحقنة ، ادفع المادة الطافية ببطء عبر المرشح ، مما يسمح لها بالتجمع في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 ملليلتر.
قم بإزالة مكبس المحقنة مرة أخرى. باستخدام ماصة دقيقة P-200، أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من PBS إلى المحقنة. أعد إدخال المكبس وادفع ببطء 200 ميكرولتر من PBS عبر المرشح لطرد أي مادة طافية متبقية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسمى.
انقل المحلول المفلتر إلى أنابيب جديدة من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر ، ومناسبة لسرعات تصل إلى 200 ، 000 جم ، وبعد إغلاق الأنابيب ، ضعها في دوار جهاز الطرد المركزي الفائق للتأكد من توازنها. قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي الفائق الصغر واضبطه على العمل لمدة ساعة واحدة عند 100 ، 000 جم وأربع درجات مئوية. ضع الدوار المحمل مع الأنابيب داخل جهاز الطرد المركزي الفائق الصغير.
أغلق الغطاء وقم بتشغيل المكنسة الكهربائية لبدء العملية. بمجرد أن يصل الفراغ إلى المستوى الثاني ، اضغط على زر البدء وانتظر حتى تكتمل عملية الطرد المركزي. بعد اكتمال دورة الطرد المركزي ، انقر فوق زر التفريغ لإعادة ضغط الغرفة قبل إزالة الدوار والأنابيب.
قم بإزالة المادة الطافية بعناية من كل أنبوب باستخدام ماصة دقيقة P-200. بعد ذلك ، استخدم نفس الماصة الدقيقة P-200 لإضافة 50 ميكرولترا من PBS إلى كل أنبوب.
