Nicht kodierende RNAs haben oft mehrere Isoformen. In In-vitro-Überexpressionsstudien ist es oft schwierig, all diese exprimierenden Isoformen zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es benutzern, die Expression direkt aus dem Genom abzuleiten und die Zellen in die Lage zu versetzen, die endogenen Isoformen für eine bestimmte nicht kodierbare RNA auszudrücken.
Diese leistungsstarke Technik ermöglicht es dem Benutzer, die Expression eines beliebigen Gens im Genom gezielt mit Genauigkeit und Genauigkeit zu lenken. Durch die Entwicklung von Führungs-RNAs zu bestimmten Genen ist man in der Lage, die endogenen Gen-Spleiß-Maschinen zu verwenden, um die natürlichen Isoformen in einer bestimmten Zelle auszudrücken. Demonstriert wird das Verfahren von Robert Rankin, einem Post-Doc aus meinem Labor.
Um die Rna-Führungssequenz zu entwerfen, die sich innerhalb von 100 Basenpaaren der transkriptionellen Startstelle befindet, verwenden Sie genetische Datenbanken wie BLAT, um sicherzustellen, dass die Guide-RNA für das gen von Interesse einzigartig ist. Bewahren Sie die Guide-RNA und die deaktivierten Cas9-Plasmide bei vier Grad Celsius auf. E.coli auf einer Luria-Brühe-Agarplatte mit Ampicillin ausstreife und die Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius züchten.
Am nächsten Tag, pflücken Sie eine Kolonie und wachsen die Bakterien in fünf Milliliter LB mit Ampicillin über Nacht, kräftig schütteln die Röhre in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator. Am nächsten Tag zwei Milliliter Bakterien zu 200 Millilitern LB mit Ampicillin in einem Zweiliterkolben hinzufügen, der den Kolben über Nacht in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator kräftig schüttelt. Drehen Sie die Bakterien bei 3, 724 mal g für 20 Minuten und gehen Sie zur DNA-Reinigung.
Um das dCas9-haltige Lentivirus zu erstellen, 100-Milliliter-Gewebekulturschalen mit fünf Millilitern 0,01%Poly-L-Lysin und Platte fünf Millionen HEK293T-Zellen pro Schale in 10 Milliliter n komplettem Dulbecco es Modified Eagles Medium, dann DNA-Transfektionsproben vorbereiten, indem 10 Mikrogramm eines LTR-haltigen Führungs-RNA-Vektors oder eines LTR-haltigen deaktivierten Cas9-Vektors mit Plasmid-haltigen Komponenten gemischt werden. Fügen Sie Wasser zu einem Gesamtvolumen von 450 Mikrolitern hinzu und filtern Sie das Gemisch durch eine 0,2-Mikron-Filterspitze, die an einer Spritze befestigt ist. Als nächstes 50 Mikroliter 2,5-Molaren-Calciumdichlorid zu jeder Transfektionsprobe der DNA hinzufügen und sanft mischen.
Filtern Sie das Calcium-DNA-Gemisch durch eine 0,2-Mikron-Filterspitze, die an einer Spritze befestigt ist. Pipette 500 Mikroliter 2X HBS in ein Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rohr. 500 Mikroliter der Calcium-DNA-Mischung tropfenweise und sanft wirbeln hinzufügen.
Bei Raumtemperatur drei Minuten lang inkubieren. Fügen Sie jeder HEK293T-haltigen Gewebekulturschale einen Milliliter der DNA-Calcium-HBS-Suspension hinzu und inkubieren Sie sie in einem 5%Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am dritten Tag, langsam entfernen und entsorgen Sie die Medien aus dem Geschirr.
Waschen Sie die Zellen vorsichtig einmal mit PBS. Fügen Sie sechs Milliliter komplettes DMEM hinzu, ergänzt durch 20-Millimolar-HEPES und 10-Millimolar-Natriumbutyrat. Dann inkubieren Sie die Zellen in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für fünf bis sechs Stunden.
Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation einmal mit PBS und fügen Sie den HEK293T-Zellen fünf Milliliter komplettes DMEM mit 20-Millimolar-HEPES hinzu. Inkubieren Sie die Zellen in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 12 Stunden. Sammeln Sie am vierten Tag die HEK293T-Zellüberstandundungen und filtern Sie den Überstand, der das Virus enthält.
Um die Anzahl der viralen Partikel zu beginnen, verdünnen Sie zunächst das Waschkonzentrat aus dem P24 ELISA-Kit, indem Sie 19 Teile destilliertes, entionisiertes Wasser hinzufügen. Verdünnen Sie dann die Positivkontrolle aus diesem Kit auf 200 Nanogramm pro Milliliter mit RPMI 1640 als Verdünnungsmittel und machen Verdünnungen für eine Standardkurve in 1,5-Milliliter-Röhren nach der P24 ELISA-Verdünnungstabelle. Um die Konzentration des Virus innerhalb der Proben zu messen, fügen Sie die Probenverdünnungen zu den vorgesehenen Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu, beginnend mit 1:1000 Verdünnung, und ändern Sie das Volumen, das erforderlich ist, um innerhalb des Bereichs der Standardkurve zu liegen.
Anschließend die Proben mit Triton X-100 auf eine Endkonzentration von 0,5% verdünnen und 200 Mikroliter jeder Probe und RPMI 1640 zu den dafür vorgesehenen Brunnen hinzufügen. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Platte mit 300 Mikroliter pro Brunnen des 1X Waschpuffers sechsmal.
Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie die Platte umkehren und auf ein Papiertuch tippen. Dann fügen Sie 100 Mikroliter Detektor-Antikörper aus dem Kit zu allen Brunnen außer dem Substrat leer. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.
Waschen Sie die Platte und entfernen Sie dann überschüssige Flüssigkeit, indem Sie die Platte invertieren und auf ein Papiertuch tippen. Um den Detektorantikörper zu messen, verdünnen Sie die Streptavidin-Meerrettichperoxidase bei 1:100 Verdünnung mit SA-HRP-Verdünnung. Mischen Sie das verdünnte SA-HRP gründlich und fügen Sie 100 Mikroliter in alle Brunnen außer dem Rohling hinzu.
Versiegeln und bebrüten die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Als nächstes waschen Sie die Platte mit dem 1X Waschpuffer und tippen Sie jede überschüssige Flüssigkeit weg. Lassen Sie eine Orthophenylendiamin-Tablette in 11 Milliliter des Substratverdünnungsstoffs fallen, um genügend Substratlösung für eine Platte zu machen.
Wirbeln Sie die OPD-Lösung kräftig auf, um sie vollständig aufzulösen und vor Licht zu schützen. Fügen Sie 100 Mikroliter OPD Substratlösung zu allen Brunnen einschließlich des Rohlings hinzu. Mit einem Spektralphotometer sofort die Absorption bei 450 Nanometern ablesen.
Wiederholen Sie 10 Mal in Intervallen von einer Sekunde und nehmen Sie die durchschnittliche Messung. Resuspend und Kultur Jurkat T-Zellen in einem T75 Kolben mit einer Dichte von einer Million Zellen in fünf Milliliter des reduzierten Serummediums mit Polybren. Fügen Sie dann HEK293T-konditionierte Medien hinzu, die eine Million dCas9-haltige Viruspartikel enthalten.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Drei Tage nach der Infektion, drehen Sie die Zellen bei 233 Zeit g für fünf Minuten und setzen Sie sie in 10 Milliliter von vollständigDMEM mit Puromycin ergänzt. Die Zellen in T75-Flaschen kulturieren und bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid bebrüten.
Jeden dritten Tag für einen Zeitraum von neun Tagen, drehen Sie die Zellen bei 233 mal g für fünf Minuten und ersetzen Sie die Medien mit dem kompletten DMEM mit Puromycin ergänzt. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Dann, auf einer 96-Well-Platte mit Gewebe kulturbehandeltem Gewebe, fügen Sie 10 000 Zellen in 100 Mikroliter des kompletten DMEM mit Puromycin im ersten Brunnen ergänzt.
Machen Sie 1:1 serielle Verdünnungen des Inhalts der folgenden Brunnen mit dem kompletten DMEM mit Puromycin ergänzt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Erweitern Sie die Klonzellen in zwei 24-Well-Platten, dann platten Sie zwei Millionen Zellen pro Bohrkörper einer Sechs-Well-Platte für drei der Klone.
Die anderen drei Brunnen mit nicht transduzierten Jurkat-Zellen als Steuerungen verschließen. Schließlich die Zellen in einen T75-Kolben geben und die Zellen über Nacht in einen Zellkultur-Inkubator geben. Um mit der quantitativen PCR zur Messung der Genexpression zu beginnen, synthetisieren Sie zunächst komplementäre DNA durch Zugabe eines Mikrogramms RNA, vier Mikroliter cDNA-Synthesepuffer und einen Mikroliter Reverse-Transkriptase zu 250 Mikroliter-Röhren, und fügen Sie dann Wasser zu einem Endvolumen von 20 Mikrolitern hinzu.
Verwenden Sie dann einen thermischen Cycler bei 42 Grad Celsius für 30 Minuten und bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, um die umgekehrte Transkriptase zu inaktivieren. Verdünnen Sie die cDNA nach der Synthese mit 60 Mikroliter Wasser. Führen Sie Polymerase-Kettenreaktionen für Rohre aus, die 0,5 Mikroliter pro Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung bei einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren, fünf MikroliterS SYBR-Grün und vier Mikroliter cDNA enthalten.
Wählen Sie schließlich Jurkat-dCas9-Zellen in DMEM, ergänzt mit Hygromycin B für 10 Tage. Drehen Sie die Zellen herunter und ändern Sie die Medien alle drei Tage. Reinigen Sie RNAse und fahren Sie mit RT-qPCR fort.
In dieser Studie wurden gRNA-Sequenzen, die innerhalb von 10 bis 100 Basenpaaren von der transkriptionellen Startstelle entfernt waren, verwendet, um den Cas9-aktivierenden Komplex auf den transkriptionellen Ort von IFNG-AS1 zu lenken, einer langen nicht kodierenden RNA, die mit entzündlichen Darmerkrankungen assoziiert ist. Um die Auswahl von doppeltransduzierten Zellen zu ermöglichen, wurde ein Zwei-Plasmid-System verwendet, um entweder dCas9 oder gRNAse Enhancer in Zellen zu transduzieren. Hier verstärken MS2-Proteine die Überexpression von IFNG-AS1.
Der Cas9-Ausdruck wurde für beide Klone bestätigt. Primer gegen HPRT1 wurden verwendet, um das Vorhandensein von RNA in den nicht transducierten Zellen zu bestätigen. die mRNA-Expression wurde durch Weglassen der Reverse-Transkriptase aus der cDNA-Reaktion bestätigt.
Drei Spleißvarianten von IFNG-AS1 konnten entweder mit Transkript-spezifischen Primer-Sets oder einem Primer-Set gegen alle bekannten IFNG-AS1-Transkripte nachgewiesen werden. Alle Fluoreszenzkurven waren exponentiell, wobei das Housekeeping-Gen HPRT1 die exponentielle Phase innerhalb eines halben Zyklus zwischen Kontrollzellen und IFNG-AS1 gRNA-exezierenden Zellen erreichte. Primer gegen alle bekannten IFNG-AS1-Transkripte waren die am meisten nachweisbaren zwischen den Experimenten, mit Messungen von 20-fachen Erhöhungen der IFNG-AS1-Expression.
Das dritte Transkript von IFNG-AS1 zeigte jedoch einen fünf- bis zehnfachen signifikanten Anstieg der IFNG-AS1-Spiegel. Um Ihr gewünschtes Gen aktiv zu überprimieren, ist die Entwicklung der Guide-RNA in Schritt 2.1 entscheidend für den Erfolg des Protokolls. Darüber hinaus sorgt die Produktion hochwertiger Viruspartikel für eine robuste Ausprägeweise Ihrer Protokollkomponenten.
Sobald das gewünschte Gen überexprimiert ist, können funktionelle Studien durchgeführt werden, um die Genmechanismen zu untersuchen. In unserem Beispiel haben wir uns entschieden, die Zytokinproduktion nach Überexpression unseres Gens von Interesse zu betrachten. Diese Technik wurde 2013 von der Griesbach-Gruppe entwickelt und von anderen Gruppen umfassend angewandt und entwickelt.
Wir waren begeistert, diese Technik auf lange nicht codierte RNAs anzuwenden, um ihre spezifischen Funktionen zu erforschen. Replikationsdefekte Lentiviren sollten in einem Labor behandelt werden, das für virale Arbeiten zugelassen ist. Darüber hinaus gelten menschliche Zelllinien und E.coli-Bakterien als biogefährlich.
Schließlich sollten rekombinante DNA-Plasmide von geschultem Personal behandelt werden.
