Los ARN no cosidos a menudo tienen varias isoformas. En estudios de sobreexpresión in vitro, a menudo es difícil estudiar todas estas isoformas expresadas. Esta técnica permite a los usuarios derivar la expresión directamente del genoma y permitir que las células expresen las isoformas endógenas para un ARN no codificante en particular.
Esta potente técnica permite al usuario dirigir específicamente la expresión de cualquier gen en el genoma con fidelidad y precisión. Mediante el diseño de ARN guía a genes específicos, uno es capaz de utilizar la maquinaria de división genética endógena para expresar las isoformas naturales en una célula dada. Demostrando el procedimiento estará Robert Rankin, un post-doc de mi laboratorio.
Para diseñar la secuencia de ARN guía que se encuentra dentro de 100 pares base del sitio de inicio transcripcional, utilice bases de datos genéticas como BLAT para asegurarse de que el ARN guía es único para el gen de interés. Almacene el ARN guía y los plásmidos Cas9 desactivados a cuatro grados centígrados. Estirar E.coli en un plato de agar de caldo de Luria con ampicilina y hacer crecer la bacteria durante la noche a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, escoge una colonia y haz crecer las bacterias en cinco mililitros de LB con ampicilina durante la noche, agitando vigorosamente el tubo en una incubadora de 37 grados Celsius. Al día siguiente, añadir dos mililitros de bacterias a 200 mililitros de LB con ampicilina en un matraz de dos litros, agitando vigorosamente el matraz durante la noche en una incubadora de 37 grados Celsius. Girar hacia abajo las bacterias a 3, 724 veces g durante 20 minutos y proceder a la purificación del ADN.
Para crear el lentivirus que contiene dCas9, primero cubra los platos de cultivo de tejido de 100 mililitros con cinco mililitros de 0.01%Poly-L-Lisine y cubra cinco millones de células HEK293T por plato en 10 mililitros de medio completo de águilas modificadas de Dulbecco, a continuación, prepare muestras de transfección de ADN mezclando 10 microgramos de un vector de ARN guía que contenga LTR o un vector Cas9 desactivado que contiene LTR con plásmidos que contienen componentes de virus. Agregue agua a un volumen total de 450 microlitros y filtre la mezcla a través de una punta de filtro de 0,2 micras conectada a una jeringa. A continuación, agregue 50 microlitros de dicloruro de calcio de 2,5 molares a cada muestra de transfección del ADN y mezcle suavemente.
Filtrar la mezcla de calcio y ADN a través de una punta de filtro de 0,2 micras unida a una jeringa. Pipetear 500 microlitros de 2X HBS en un tubo de poliestireno de cinco mililitros. Añadir 500 microlitros de la mezcla de calcio-ADN gotas y vórtice suavemente.
Incubar a temperatura ambiente durante tres minutos. Añadir un mililitro de la suspensión HBS de ADN-calcio a cada plato de cultivo de tejido que contenga HEK293T e incubarlos en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante la noche. El tercer día, retire y deseche lentamente los medios de comunicación de los platos.
Lave cuidadosamente las células con PBS una vez. Añadir seis mililitros de DMEM completo complementado con HEPES de 20 mililitros y butirato de sodio de 10 mililitros. Luego incubar las células en una incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados durante cinco a seis horas.
Después de la incubación, lavar las células con PBS una vez y añadir cinco mililitros de DMEM completo con HEPES de 20 mililitros a las células HEK293T. Incubar las células en una incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados durante 12 horas. En el cuarto día, recoja los sobrenadantes de células HEK293T y filtre el sobrenadante que contiene el virus.
Para comenzar el recuento de partículas virales, primero diluya el concentrado de lavado del kit ELISA P24 añadiendo 19 partes de agua destilada y desionizada. A continuación, diluir el control positivo de este kit a 200 nanogramos por mililitro utilizando RPMI 1640 como diluyente y hacer diluciones para una curva estándar en tubos de 1,5 mililitros según la tabla de dilución ELISA P24. Para medir la concentración del virus dentro de las muestras añadir las diluciones de la muestra a los pocillos designados de una placa de 96 pocillos, a partir de 1:1000 dilución y modificar el volumen según sea necesario para estar dentro del rango de la curva estándar.
A continuación, diluya las muestras con Triton X-100 a una concentración final del 0,5% y añada 200 microlitros de cada muestra y RPMI 1640 a los pozos designados. Selle la placa e intepe a 37 grados centígrados durante dos horas. Lave la placa con 300 microlitros por pozo del tampón de lavado 1X seis veces.
Retire cualquier exceso de líquido invirtiendo la placa y golpeándola en una toalla de papel. A continuación, añada 100 microlitros de anticuerpo detector del kit a todos los pozos excepto al sustrato en blanco. Selle la placa e intepe a 37 grados centígrados durante una hora.
Lave la placa y luego retire el exceso de líquido invirtiendo la placa y golpeándola en una toalla de papel. Para medir el anticuerpo detector, diluya la peroxidasa de rábano picante estreptavidina a 1:100 dilución con diluyente SA-HRP. Mezclar bien el SA-HRP diluido y añadir 100 microlitros a todos los pozos excepto el espacio en blanco.
Selle e incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, lave la placa con el tampón de lavado 1X y toque cualquier exceso de líquido. Deje caer un comprimido de ortofenilendiamina en 11 mililitros del diluyente del sustrato para hacer suficiente solución de sustrato para una placa.
Vórtice la solución OPD vigorosamente para disolverla por completo y protegerla de la luz. Agregue 100 microlitros de solución de sustrato OPD a todos los pomos, incluido el espacio en blanco. Usando un espectrofotómetro, lea la absorbancia a 450 nanómetros inmediatamente.
Repita 10 veces a intervalos de un segundo y tome la medida media. Resuspend y cultivo de células T De Jurkat en un matraz T75 con una densidad de un millón de células en cinco mililitros de los medios séricos reducidos con polibreno. A continuación, agregue medios condicionados por HEK293T que contengan un millón de partículas virales que contengan dCas9.
Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Tres días después de la infección, girar hacia abajo las células a 233 g tiempo durante cinco minutos y resuspend a ellos en 10 mililitros de DMEM completo complementado con puromicina. Cultivo de las células en matraces T75 e incubarlas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
Cada tercer día durante un período de nueve días, girar hacia abajo las células a 233 veces g durante cinco minutos y reemplazar los medios con el DMEM completo complementado con puromicina. Cuente las células utilizando un hemocitoómetro o un contador de células automatizado. Luego, en una placa de 96 pozos con tejido tratado con tejido, agregue 10.000 células en 100 microlitros del DMEM completo complementado con puromicina en el primer pozo.
Hacer 1:1 diluciones en serie del contenido de los siguientes pozos con el DMEM completo complementado con puromicina. Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Expanda las células clonales en dos placas de 24 pozos, luego plate dos millones de células por pozo de una placa de seis pozos para tres de los clones.
Placa los otros tres pozos con células Jurkat no transducidas como controles. Finalmente, platina las células en un matraz T75 y coloca las células en una incubadora de cultivo celular durante la noche. Para comenzar la PCR cuantitativa para medir la expresión génica, primero sintetice el ADN complementario añadiendo un microgramo de ARN, cuatro microlitros de tampón de síntesis de ADNn. y un microlitro de transcriptasa inversa a 250 tubos de microlitro, luego agregue agua a un volumen final de 20 microlitros.
Luego, utilice un ciclor térmico a 42 grados Celsius durante 30 minutos y a 95 grados Celsius durante cinco minutos para inactivar la transcriptasa inversa. Diluir el ADNc con 60 microlitros de agua después de la síntesis. Ejecutar reacciones en cadena de polimerasa para tubos que contienen 0,5 microlitros de cada imprimación hacia adelante y hacia atrás a una concentración final de 10 micromolares, cinco microlitros de verde SYBR y cuatro microlitros de ADNc.
Finalmente seleccione Las células de Jurkat-dCas9 en DMEM suplementados con higromicina B durante 10 días. Gire hacia abajo las células y cambie los medios cada tres días. Purify RNAse y proceda a RT-qPCR.
En este estudio, las secuencias de ARNN que estaban dentro de 10 a 100 pares base lejos del sitio de inicio transcripcional se utilizaron para dirigir el complejo activador de Cas9 al locus transcripcional de IFNG-AS1, un ARN no codificante largo asociado con la enfermedad inflamatoria intestinal. Para permitir la selección de células transducidas dobles, se utilizó un sistema de dos plásmidos para transducir potenciadores dCas9 o gRNAse en células. Aquí las proteínas MS2 mejoran la sobreexpresión de IFNG-AS1.
Se confirmó la expresión Cas9 para ambos clones. Los primeros contra HPRT1 se utilizaron para confirmar la presencia de ARN en las células no transducidas. La expresión de ARNm se confirmó omitiendo la transcriptasa inversa de la reacción del ADNr.
Se podrían detectar tres variantes de empalme de IFNG-AS1 con conjuntos de imprimación específicos de transcripción o un conjunto de imprimación en todas las transcripciones CONOCIDAs de IFNG-AS1. Todas las curvas de fluorescencia fueron exponenciales con el gen de limpieza HPRT1 alcanzando la fase exponencial dentro de un medio ciclo entre el control y las células que expresan el GRNA IFNG-AS1. Los primeros contra todas las transcripciones conocidas de IFNG-AS1 fueron los más detectables entre experimentos, con mediciones de aumentos de 20 veces en la expresión IFNG-AS1.
Sin embargo, la tercera transcripción de la IFNG-AS1 mostró un aumento significativo de cinco a 10 veces en los niveles de IFNG-AS1. Para sobreexpresar activamente el gen deseado, el diseño del ARN guía en el paso 2.1 es fundamental para el éxito del protocolo. Además, la producción de partículas virales de calidad garantizará una expresión robusta de sus componentes de protocolo.
Una vez que el gen deseado está sobreexpresado, se pueden realizar estudios funcionales para investigar los mecanismos genéticos. En nuestro ejemplo, elegimos examinar la producción de citoquinas después de la sobreexpresión de nuestro gen de interés. Esta técnica fue desarrollada inicialmente por el Grupo Griesbach en 2013 y ha sido ampliamente aplicada y elaborada por otros grupos.
Estábamos encantados de aplicar esta técnica a los ARN no codificados durante mucho tiempo con el fin de explorar sus funciones específicas. Los lentivirus defectuosos por replicación deben manipularse en un laboratorio que haya sido aprobado para el trabajo viral. Además, las líneas celulares humanas y las bacterias E. coli se consideran biopeligrosas.
Por último, los plásmidos de ADN recombinantes deben ser manejados por personal capacitado.
