إن استرداد الفلورس الموجود بعد التحسس الضوئي، وبروتوكولات FRAP، إما غير مكتمل أو معقد بشكل مفرط. البروتوكول المعروض في هذا الفيديو مهم من حيث أنه شامل وعملي ومباشر. والميزة الرئيسية لهذه التقنية FRAP هو أنه يسمح لك بالكمية من تنقل البروتين داخل وفيما بين مقصورات الخلايا الفرعية في الخلايا الحية.
ويجري حاليا دراسة البرنامج لأغراض علاجية وتشخيصية على السواء. ومن هذه الاستخدامات تحديد مدى الانتشار داخل نظم تسليم المخدرات في أنسجة مختلفة في الجسم الحي. ويمكن لهذه المعلومات باستخدام لتحسين بنية المخدرات وتكوينها.
وقد وفرت تقنية التحليل المجهري لـ FRAP رؤى في مجموعة واسعة من المجالات التي يكون فيها فهم ظاهرة الانتشار أمرًا مهمًا. وتشمل هذه الخلايا والبيولوجيا الجزيئية، والبيولوجيا التنموية، وعلم الأعصاب، وعلوم المواد، والمواد الحيوية المتقدمة، واكتشاف المخدرات. على الرغم من أن البروتوكول الموصوف للاستخدام مع خلايا الثدييات ، يمكن تطبيق المفاهيم على أنظمة أخرى ، مثل الخلايا النباتية وخلايا الخميرة والبكتيريا.
فرد الذي لم يسبق له أن أدى هذه التقنية قد النضال في تحديد الأمثل المعلمات الحصول على صورة ، وخلق منطقة الاستحواذ من الفائدة التي هي مناسبة للتجربة ، وحساب جزء المحمول ونصف من الانتعاش. عند محاولة هذا الإجراء لأول مرة، تأكد من إجراء العديد من التجارب التجريبية لتحسين البروتوكول في سياق أهداف تجربتك. إثبات الإجراء سيكون (ماليين كايب) فني من مختبري و(ديفيد راديماخر) مدير منشأة التصوير الأساسية
للبدء، إعداد لوحة من YFP-p62 المتحولة الخام 264.7 الضامة، وعلاجها مع السكاريد Lipopolys كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. بعد ذلك ، شطف الخلايا المعالجة مع عازلة تايرود الباردة الجليد مرة واحدة. ثم، إضافة ملليلتر اثنين من المخزن المؤقت التيرودي نوكودزول المكمل إلى لوحة، والسماح لوحات لاحتضان في أربع درجات مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة قبل التصوير FRAP والتحليل.
السماح للألواح لاحتضان في أربع درجات مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة قبل التصوير FRAP والتحليل. في أكثر من الإعداد التصوير، حدد خط 514 نانومتر من الليزر أرغو/2، كما علامة الفلوريسنس لديه استثارة الذروة في 512 نانومتر، وانبعاثات الذروة في 527 نانومتر. بعد ذلك، في إطار التحكم في الليزر، انقر فوق Argon/2، 458، 477، 488، 514، ثم انقر فوق الزر "الاستعداد".
بعد الانتظار حوالي ثلاث دقائق بالليزر للاحماء، انقر فوق الزر على. ثم تعيين قوة الليزر من الليزر إلى 100٪ واضغط Enter. المقبل، تعيين انتقال خط الليزر إلى 5٪ على المجهر، أنتقل إلى خطة-Apochromat 63x تكبير 1.40 رقمية فتحة هدف النفط.
عرض العينة من خلال العدسة المجهر ووضع بنية مستحثة aggresome تشبه في وسط مجال الرؤية. ثم، في برنامج الاستحواذ، تعيين حجم الإطار إلى 512 في 512 بكسل، وسرعة المسح الضوئي إلى ثمانية، وعمق البيانات إلى 12 بت. كما يمكنك تعيين متوسط المسح الضوئي إلى واحد، والتكبير البصري إلى ثلاثة، واضغط على Enter.
بعد ذلك ، se الثقب إلى 1.95 خطأ وحدات واكسب كاشف إلى 582 ، وهو أقل بقليل من التشبع. إنشاء منطقة مربعة الشكل من الفائدة للحصول على الصورة، التي لديها أبعاد 150 في 150 بكسل. قم بإعداد السلاسل الزمنية بحيث يتم مسح المنطقة التي تهمها ضوئيًا 35 مرة، مرة كل 30 ثانية.
ثم، تعيين التحكم في التبييض بحيث photobleaching سيحدث بعد المسح الضوئي رقم خمسة، لجمع خمس صور prebleach من المنطقة ذات الأهمية. اضغط على مفتاح Enter للتأكيد. بعد ذلك، انتقل إلى نافذة "مناطق التبييض" وإنشاء منطقة التبييض دائرية الشكل من الفائدة داخل منطقة بنية مستحثة aggresome-like، التي يبلغ قطرها 10 بكسل.
الآن، قم بتعيين عدد التكرارات إلى 300، واضغط مرة أخرى على مفتاح Enter. ثم، تعيين خط الليزر إلى 100٪ الطاقة، وأدخل 100 في مجال نقل النسبة المئوية بالليزر، واضغط Enter. وأخيرا ، تشغيل برنامج الحصول على صورة لجمع البيانات FRAP من 10 الهياكل aggresome مثل الناجمة في 10 خلايا مع أقل من حوالي ثلاثة ميكرون من الانجراف.
لبدء تحليل البيانات، قم أولاً بنقل ملفات AIM lsm إلى جهاز كمبيوتر شخصي لتحليل البيانات. تصحيح ل الانجراف الصورة عن طريق محاذاة أو مطابقة كومة من الصور سلسلة الوقت من منطقة الاستحواذ من الفائدة من خلال فتح كل ملف AIM lsm مع برنامج معالجة الصور. ثم، حدد الإضافات والتسجيل StackReg والترجمة، متبوعاً بتحديد الإضافات والتسجيل StackReg ثم نص جامد.
المقبل ، قم بإعداد إدارة المنطقة من المصالح لقياس كثافة الإشارة في منطقة التبييض من الفائدة. لهذا، حدد الأداة البيضاوية ثم رسم دائرة في منطقة التبييض من الفائدة مع قطر 10 بكسل، ثم انقر فوق الزر إضافة. مرة واحدة تضاف ، وإعداد البرنامج لقياس كثافة الإشارة في منطقة السيطرة من الفائدة.
حدد أداة المستطيل، ثم ارسم مربعًا من 20 بكسل في 20 بكسل في منطقة التحكم، وانقر على الزر إضافة. وأخيرا ، قم بإنشاء منطقة من المصالح مدير لقياس كثافة الإشارة في منطقة خلفية من الفائدة. حدد أداة المستطيل، وارسم مربعًا من 20 بكسل في 20 بكسل في منطقة الخلفية، ثم انقر فوق الزر إضافة.
بعد إضافة المناطق التي سيتم تحليلها في مدير ROI ، إعادة تسميتها تبييض العائد على الاستثمار ، ومراقبة العائد على الاستثمار ، والعائد على خلفية ، وفقا لذلك. قياس كثافة الإشارة في كل منطقة. لإنجاز ذلك، حدد "عائد الاستثمار" Bleach و "التحكم في العائد على الاستثمار" و"عائد الاستثمار في الخلفية"، ثم انتقل إلى المزيد، وحدد Multi Measure.
قم بلصق النتائج في جدول بيانات في أعمدة تحمل عنواناً "عائد الاستثمار الخاص بـ Bleach" و"عائد الاستثمار التحكم" و"عائد الاستثمار في الخلفية" على التوالي. ابدأ بخلفية تصحيح كثافة الإشارة في ROI Bleach و ROI التحكم بطرح القيم في العمود المسمى عائد الاستثمار في الخلفية من القيم في العمود المسمى "ROI التبييض" والعمود المسمى "عائد الاستثمار التحكم". تسمية هذه الأعمدة الجديدة تصحيح العائد على الاستثمار التبييض وتصحيح العائد على الاستثمار التحكم.
بعد ذلك، تطبيع الإشارة في ROI التبييض إلى الإشارة تصحيح الخلفية في العائد على الاستثمار التحكم. تقسيم القيم في العمود المسمى "ROI التبييض" مصححة حسب القيم في العمود المسمى "تصحيح العائد على الاستثمار التحكم". تسمية هذا العمود الجديد ، تطبيع تصحيح التبييض ROI.
ثم، تطبيع الإشارة في العمود "معدل تصحيح التبييض" إلى متوسط قيم prebleach الخمسة في "عائد الاستثمار التبييض". تقسيم القيم في العمود المسمى تطبيع تصحيح التبييض ROI حسب متوسط قيم prebleach الخمسة في "عائد الاستثمار التبييض". تسمية هذا العمود الجديد، تطبيع تصحيح Prebleach متوسط التبييض ROI.
وأخيراً، افتح برنامجًا لمعالجة الصور. منحنى تناسب تطبيع وتصحيح بيانات العائد على الاستثمار التبييض عن طريق نسخ postbleach تطبيع تسويتها قيم العائد على الاستثمار التبييض وتصحيحها والقيم الزمنية المقابلة. لصقها في إطار الأصلح المنحنى، حدد استرداد أسي من القائمة المنسدلة أصلح المنحنى، وحدد احتواء.
يظهر هنا هو نموذجي فيديو من الانتعاش fluorescence بعد photobleaching لP264.7 الخلايا المعالجة مع LPS. انتعاش الفلوريسنس داخل منطقة الهيكل المستحث aggresome مثل الفائدة ، بطيئة. تستخدم هذه التجربة التحسس الضوئي لفحص درجة التنقل p62.
p62 fluorescence في الهياكل المستحثة aggresome مثل، prebleach و postbleach، هو مبين هنا. كما هو موضح في هذا الفيديو، يمكن تتبع كثافة الفلوريسنس مع مرور الوقت. بعد تصحيح الخلفية والتطبيع، يمكن حساب الفلوري p62 لوصف الكسر المتنقل كـ 22٪ الكسر غير المتحرك كـ 78٪، ويصف نصف الوقت من الانتعاش داخل الهياكل المستحثة aggresome- مثل، كما 2.14 دقيقة.
تذكر، من المهم بشكل خاص تحديد منطقة الاستحواذ بشكل صحيح من الفائدة بحيث يتضمن ALIS من الفائدة، منطقة مراقبة من الفائدة، ومنطقة خلفية من الاهتمام. بعد هذا الإجراء، يمكن تطبيق تقنيات أخرى المجهر الفلورسنت الكمية الأخرى، مثل فقدان الفلوريسنس في photobleaching، الوجه، وphotobleaching انتقائية. في حين أن الوجه يقيس درجة الاستمرارية والتواصل بين المقصورات دون الخلوية ، فإن التصوير الضوئي الانتقائي يوفر معلومات حركية حول النقل النشط والسلبي للبروتينات إلى العضيات ، أو بين المناطق الغنية بالبروتين.
وقد تم تطوير FRAP في البداية لتحديد الحركة الجانبي للبروتينات في أغشية الخلايا. وفي وقت لاحق، تم استخدامه لقياس حركة البروتين داخل وفيما بين مجموعة متنوعة من المقصورات دون الخلوية، مما مهد الطريق للباحثين للإجابة على الأسئلة في مجموعة متنوعة من المجالات، بما في ذلك البيولوجيا الخلوية والجزيئية، والبيولوجيا التنموية، وعلم الأعصاب، وعلوم المواد، والمواد الحيوية المتقدمة، واكتشاف الأدوية.
