اليوم نحن ذاهبون لتقديم يرقات حمار البحر حمار البحر PDX النموذجي. هذا النموذج هو مهم لأنها يمكن أن تحاكي أفضل تكوين الخلوية مماثلة في xenograft لتقييم الاستجابات المخدرات وأيضا زيادة تحسين اتساق النتائج مع تحليلنا المقارن. هناك نوعان من المزايا الرئيسية لهذه التقنية.
أولا، نستخدم مختلف الأصباغ الكيميائية القياسية لتسمية الخلايا في الفلورس المختلفة، مما يسمح لتتبع في الوقت الحقيقي من التراكيب الخلوية وقدرة مرحلة الانجراف. ثانيا ، فإنه يحسن أيضا الوقت العام للبقاء على قيد الحياة من الخلايا البشرية في حمار وحشي ، وتعديلها الجيني ، الذي يوفر نافذة مراقبة أطول لاختبار المخدرات. توفر هذه التقنية نموذجًا محتملًا للطب الشخصي للمرضى المصابين بسرطان البنكرياس وكذلك للتقييم المسبق لدواء الورم قبل السريري.
ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتتبع الخلايا السرطانية الأخرى أو لا الخلايا السرطانية xenografted في حمار وحشي في الجسم الحي وتحسين بقاء الخلية لفترة أطول الملاحظة. لإعداد لوحة الحقن، إعداد محلول 50 ملليلتر من 1٪ agarose في حل E3. يغلي الحل حتى يذوب agarose.
صب الحل بأكمله في طبق بيتري 10 سنتيمترا ثم ضع قالب تثبيت جنين حمار وحشي على السطح. عندما يقوي الحل agarose تماما، وإزالة القالب. لإعداد حقن الإبر، واستخدام إبرة سحب لسحب الشعرية الزجاجي 10 سم مع البعد الداخلي من 0.9 ملليمتر في إبرة اثنين.
باستخدام المجهر والملقط، وقطع نهاية الإبرة لخلق فتحة. أولاً، ضع 1 إلى 2 أزواج من سمك الحمار الوحشي البالغ في خزان تزاوج حوالي الساعة 7 إلى 9 مساءً. في الساعة الثامنة صباحاً في صباح اليوم التالي، اجمع البيض المخصب. نقل البيض المخصب إلى طبق بيتري يحتوي على 40 ملليلتر من محلول E3 الطازج.
احتضان في 28.5 درجة مئوية. أولاً، نقل عينة سرطان البنكرياس التي تم جمعها إلى طبق بيتري. شطف الأنسجة من خمس إلى ست مرات مع برنامج تلفزيوني واستخدام مشرط لقطع الأنسجة إلى قطعة مكعبة ملليمتر واحد.
بعد ذلك، نقل الأنسجة الممزقة إلى أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من HBSS. إضافة الكولاجين من النوع الرابع، الهيالوروديناز، وDNAse واحد في التركيزات النهائية هو مبين هنا. الميوط الخليط صعودا وهبوطا لخلط جيدا.
احتضان الخليط في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة 15 إلى 20 دقيقة. الماصات الخليط صعودا وهبوطا عدة مرات كل خمس دقائق. إضافة سبعة ملليلتر من DMEM إلى الأنبوب.
جهاز طرد مركزي في 110 مرات G و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، decant الماحشة وإعادة تعليق خليط الورم في DMEM. لوحة الخليط في اثنين من ستة أطباق بيتري سنتيمتر تحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسائل الإعلام النمو الكامل اسمه المجموعة الأولى والمجموعة الثانية.
احتضان كلتا المجموعتين في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪. بعد 48 ساعة، إضافة مثبط 100x من الخلايا الليفية سرطان البنكرياس في وسط المجموعة الأولى لإزالة الخلايا الليفية المتضخمة، وترك الخلايا السرطانية وأنواع الخلايا الرئيسية. متابعة احتضان باستخدام الشروط السابقة.
بعد إنتاج فيروس العدس، بذور الخلايا التي سيتم المصابة في لوحة 12-جيدا مع 30 إلى 40٪ كثافة. زراعة الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪. في اليوم التالي، استبدل الوسيط بـ 500 ميكرولتر من المتوسطة الخالية من المصل التي تحتوي على البوليبرين بتركيز ثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر.
احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات. ثم، إضافة 100 ميكرولترات إضافية من فيروس العدس إلى المتوسطة واحتضان مرة أخرى لمدة 12 ساعة. بعد 12 ساعة، استبدل الوسيط بمليلترين كاملين ومتوسطين واحتضان لمدة 36 ساعة إضافية.
بعد 36 ساعة، تحقق من علامات الفلوريسنس. حصاد الخلايا المصابة وخلطها بنسبة واحد إلى واحد مع تركيز النهائي من مليون خلية لكل ملليلتر. الطرد المركزي الخلايا في 110 مرات G لمدة خمس دقائق وإعادة تعليق خليط الخلية في 50 ميكرولترات من محلول الحقن.
بعد تخدير يرقات حمار وحشي ، قم بنقلها إلى لوحة الحقن ، والتي تمتلئ بـ E3 المعدلة. تناول 25 ميكرولترات من تعليق الخلية المختلطة في إبرة الكابيلا الدقيقة وأدخل الإبرة في المتلاعب بالجنون الدقيق. تعيين ضغط الحقن والوقت وحقن 50 إلى 80 الخلايا في كيس صفار من 48 ساعة بعد التخصيب حمار وحشي. أولاً، نقل يرقات أسماك الحمار الوحشي بعد الزينوغرف إلى 40 ملليلتر من محلول المزيج عند 32 درجة مئوية.
ضع 10 يرقات زنوجرافت في كل بئر من 12 بئرا. بعد ذلك ، تقسيم اليرقات إلى أربع مجموعات. علاج مجموعة التحكم مع E3 التي تحتوي على 0.1٪ DMSO وعلاج المجموعات الأخرى مع Gemcitabine و / أو Navitoclax.
احتضان جميع اليرقات في 32 درجة مئوية لمدة يومين. بعد تخدير اليرقات zenografted بعد العلاج ، ووضعها في 3 ٪ الميثيل السليلوز. استخدم المنظار الفلوري أو المجهر النافق لتصوير اليرقات من المنظر الجانبي.
ثم، استخدم الصورة J و برنامج لوحة الرسم البياني لتحديد شدة إشارات الفلورس الأحمر والأخضر. في هذه الدراسة, خلايا الأنسجة السرطانية الأولية هي بذور في المتوسط الكامل بعد الهضم مع أو بدون إضافة مثبطات الخلايا الليفية سرطان البنكرياس. يتم إثراء الخلايا السرطانية والخلايا الليفية كاثنين من السكان متميزة.
ويهيمن على السكان الذين لا توجد مثبطات من قبل الخلايا الليفية في حين أن نمو الخلايا السرطانية يسود بعد إضافة مثبطات. تم بناء ناقلين التغليف العدسي الفيروسي التي تعبر عن البروتينات الفلورية الخضراء أو الحمراء في BCL2L1. يمثل وضع الملصقات الفلورية المستندة إلى الفيروسات حالة البقاء للخلايا.
يتم حقن الخلايا السرطانية المختلطة والليفية في صفار حمار الحمار الوحشي في 48 ساعة بعد الإخصاب ثم يتم علاجها مع Gemcitabine و / أو Navitoclax لمدة يومين. يتم تغيير viabilities الخلية في مختلف السكان والتكوين الخلوي من زينوجافت كاستجابات للعلاج من المخدرات. عند معالجة أنواع مختلفة من الأورام، وهناك العديد من الخطوات التي قد تحتاج إلى أن يعترض، بما في ذلك وقت هضم الخلية، جرعة العلاج من المخدرات، وهلم جرا.
تساعد هذه التقنية الباحثين على توظيف حمار وحشي من مقايسة CGX أو PDS القياسية. وهو يسمح لخلط وحقن الخلايا المختلفة بنسب ثابتة لتحديد نطاقات التقدم من خلال مقارنتها بنمو الخلايا. الحماية الشخصية ذات أهمية كبيرة، وخاصة عند تغليف فيروس العدس.
ارتداء أقنعة وقفازات عند الاقتضاء، وليس محاولة لخلط على الجلد.
