Hoy vamos a presentar un modelo de larvas Zebrafish PDX. Este modelo es significativo porque pueden imitar mejor una composición celular similar en el xenoinjerto para evaluar las respuestas de los fármacos y también mejora aún más la consistencia de los resultados con nuestro análisis comparativo. Hay dos ventajas principales de esta técnica.
En primer lugar, utilizamos varios tintes químicos estándar para etiquetar las células en diferentes fluorescencias, permitiendo el rastreo en tiempo real de las composiciones celulares y la capacidad de la fase de anógrafo. En segundo lugar, también mejora el tiempo de supervivencia general de las células humanas en el pez cebra, su modificación genética, que proporciona una ventana de observación más larga para las pruebas de drogas. Esta técnica proporciona un modelo potencial para la medicina personalizada para pacientes con cáncer de páncreas y también para la pre-evaluación de fármaco tumoral preclículo.
Este método también se puede utilizar para rastrear otras células tumorales o ninguna célula tumoral xenoinjertada en peces cebra in vivo y para mejorar la supervivencia celular durante más tiempo de observación. Para preparar la placa de inyección, prepare una solución de 50 mililitros de 1% de agarosa en solución E3. Hervir la solución hasta que la agarosa se disuelva.
Vierta toda la solución en un plato Petri de 10 centímetros y luego coloque el molde de fijación de embriones Zebrafish sobre la superficie. Cuando la solución de agarosa se solidifique por completo, retire el molde. Para preparar las agujas de inyección, utilice un tirador de aguja para tirar de un capilar de vidrio de 10 centímetros con una dimensión interna de 0,9 milímetros en dos agujas.
Con un microscopio y fórceps, corte el extremo de la aguja para crear una abertura. En primer lugar, coloque de uno a dos pares de peces cebra adultos en un tanque de apareamiento alrededor de las siete y nueve PM. A las ocho de la mañana siguiente, recoge los huevos fertilizados. Transfiera los huevos fertilizados a un plato de Petri que contenga 40 mililitros de solución E3 fresca.
Incubar a 28,5 grados centígrados. Primero, transfiera la muestra de cáncer de páncreas recogida a un plato de Petri. Enjuague el tejido de cinco a seis veces con PBS y use un bisturí para cortar el tejido en trozos en cubos de un milímetro.
A continuación, transfiera el tejido triturado a un tubo de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de HBSS. Añadir colagenasa tipo cuatro, hialurodinase, y DNAse uno en las concentraciones finales que se muestran aquí. Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.
Incubar la mezcla a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del 5% durante 15 a 20 minutos. Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces cada cinco minutos. Añadir siete mililitros de DMEM al tubo.
Centrifugar a 110 veces G y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego, decantar el sobrenadante y volver a suspender la mezcla tumoral en DMEM. Plato de la mezcla en dos platos Petri de seis centímetros que contienen tres mililitros de medios de crecimiento completo llamados grupo uno y grupo dos.
Incubar ambos grupos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del 5%. Después de 48 horas, añadir 100x inhibidor de los fibroblastos de cáncer de páncreas en el medio del grupo uno para eliminar los fibroblastos crecidos, dejando las células cancerosas como los principales tipos de células. Continúe incubando utilizando las condiciones anteriores.
Después de producir el lentivirus, sembrar las células que se infectan en una placa de 12 pozos con 30 a 40% de densidad. Cultivo de las células durante la noche a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono 5%. Al día siguiente, sustituya el medio por 500 microlitros de medio sin suero que contenga polibrena a una concentración de ocho microgramos por mililitro.
Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas. A continuación, añadir 100 microlitros adicionales del lentivirus al medio e incubar de nuevo durante 12 horas. Después de 12 horas, sustituya el medio por dos mililitros de medio completo e incubar durante 36 horas adicionales.
Después de 36 horas, compruebe los marcadores de fluorescencia. Cosecha las células infectadas y mézclalas en una proporción de uno a uno con una concentración final de un millón de células por mililitro. Centrifugar las células a 110 veces G durante cinco minutos y volver a suspender la mezcla celular en 50 microlitros de solución inyectable.
Después de anestesiar las larvas de pez cebra, transfiéralas a la placa de inyección, que está llena de E3 modificado. Tome 25 microlitros de la suspensión de células mixtas en la aguja microcapillar e inserte la aguja en el manipulador de microinyección. Ajuste la presión y el tiempo de inyección e inyecte de 50 a 80 células en el saco de yema de 48 horas después de la fertilización de zebrafish. En primer lugar, transfiera las larvas de pez cebra post-zenoinjertado a 40 mililitros de solución de mezcla a 32 grados centígrados.
Coloque 10 larvas zenoinjertadas en cada pozo de una placa de 12 pozos. A continuación, divida las larvas en cuatro grupos. Tratar el grupo de control con E3 que contiene 0.1%DMSO y tratar a los otros grupos con Gemcitabine y/o Navitoclax.
Incubar todas las larvas a 32 grados centígrados durante dos días. Después de anestesiar las larvas zenoinjertadas después del tratamiento, colóquelas en 3%metilcelulosa. Utilice una fluorescencia o un microscopio confocal para tomar imágenes de las larvas desde la vista lateral.
A continuación, utilice la imagen J y el software de pad gráfico para cuantificar la intensidad de las señales de fluorescencia roja y verde. En este estudio, las células del tejido canceroso primario se siembran en un medio completo después de la digestión con o sin la adición de inhibidores de los fibroblastos del cáncer de páncreas. Las células cancerosas y los fibroblastos se enriquecen como dos poblaciones distintas.
La población sin inhibidores está dominada por fibroblastos, mientras que el crecimiento de las células cancerosas prevalece después de la adición de inhibidores. Se construyen dos vectores de envasado lentiviral que expresan proteínas fluorescentes verdes o rojas en BCL2L1. El etiquetado de fluorescencia basado en virus representa el estado de supervivencia de las células.
Las células cancerosas mixtas y los fibroblastos se inyectan en el saco de yema de pez cebra a las 48 horas después de la fertilización y luego se tratan con Gemcitabina y/o Navitoclax durante dos días. Las 200 capacidades celulares en diferentes poblaciones y la composición celular del zenoinjerto se cambian como las respuestas al tratamiento farmacológico. Al procesar diferentes tipos de tumores, hay varios pasos que pueden necesitar ser objetados, incluyendo el tiempo de digestión celular, dosis de tratamiento de drogas, y así sucesivamente.
Esta técnica ayuda a los investigadores a emplear Zebrafish a partir de un ensayo estándar CGX o PDS. Permite la mezcla e inyección de diferentes células en proporciones fijas para cuantificar las bandas de progreso comparándolas con el crecimiento celular. La protección personal es de gran importancia, especialmente cuando se empaqueta lentivirus.
Use máscaras y guantes cuando sea apropiado y trate de no mezclar en la piel.
