Сегодня мы собираемся представить личинки Зебрафиш PDX модели. Эта модель имеет важное значение, поскольку они могут лучше имитировать аналогичный клеточный состав в ксенотрансплантате для оценки реакции препарата, а также еще больше улучшает консистенцию результатов с помощью нашего сравнительного анализа. Есть два основных преимущества этой техники.
Во-первых, мы используем различные стандартные химические красители для обозначения клеток в различные флуоресценции, что позволяет в режиме реального времени отслеживания клеточных композиций и способность фазы анаграфа. Во-вторых, это также улучшает общее время выживания клеток человека в зебрафиш, их генетическая модификация, которая обеспечивает более длинное окно наблюдения для тестирования на наркотики. Этот метод обеспечивает потенциальную модель персонализированной медицины для пациентов с раком поджелудочной железы, а также для предварительной оценки доклинического препарата опухоли.
Этот метод также может быть использован для отслеживания других опухолевых клеток или нет опухолевых клеток, ксенотрансплантированных в зебрафиш in vivo и улучшить выживание клеток в течение более длительного времени наблюдения. Для приготовления инъекционной пластины приготовьте 50 миллилитровый раствор 1%agarose в растворе E3. Отварить раствор до тех пор, пока агароза не растворится.
Налейте весь раствор в 10-сантиметровую чашку Петри, а затем поместите форму фиксации эмбриона Зебрафиш на поверхность. Когда раствор агарозы полностью затвердевает, удалите форму. Для подготовки иглы для инъекций используйте иглу для вытягивать 10-сантиметровую стеклянную капиллярную капиллярную часть с внутренним измерением 0,9 миллиметра на две иглы.
Используя микроскоп и типсы, вырежьте конец иглы, чтобы создать отверстие. Во-первых, поместите одну-две пары взрослых зебры в брачный резервуар около семи-девяти вечера. На следующее утро в восемь утра собирайте оплодотворенные яйцеклетки. Перенесите оплодотворенные яйца в чашку Петри, содержащую 40 миллилитров свежего раствора Е3.
Инкубация при 28,5 градусах по Цельсию. Во-первых, передать собранный образец рака поджелудочной железы в чашку Петри. Промыть ткани пять-шесть раз с PBS и использовать скальпель, чтобы сократить ткани на один миллиметр кубированных частей.
Затем перенесите измельченную ткань в 50-миллилитровую трубку, содержащую пять миллилитров HBSS. Добавьте коллагеназу типа 4, гиалуродиразу и ДНК-1 в окончательных концентрациях, показанных здесь. Pipette смесь вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать.
Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода в течение 15-20 минут. Pipette смесь вверх и вниз несколько раз каждые пять минут. Добавьте в трубку семь миллилитров DMEM.
Центрифуга при 110 градусах G и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Затем, декант supernatant и повторно приостановить опухолевой смеси в DMEM. Плита смесь в два шести сантиметра Петри блюда, содержащие три миллилитров полного роста средств массовой информации имени группы 1 и второй группы.
Инкубировать обе группы при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода 5%. После 48 часов, добавить 100x ингибитор рака поджелудочной железы фибробластов в среде группы 1, чтобы удалить заросшие фибробласты, в результате чего раковые клетки в качестве основных типов клеток. Продолжить инкубацию с использованием предыдущих условий.
После производства лентивируса, семена клеток, которые будут инфицированы в 12-хорошо пластины с 30 до 40% плотности. Культура клетки ночь на 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа инкубатора. На следующий день замените среду 500 микролитров среды, свободной от сыворотки, содержащей полибрен при концентрации в восемь микрограмм на миллилитр.
Инкубационный при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение четырех часов. Затем добавьте в среду еще 100 микролитров лентивируса и снова инкубировать в течение 12 часов. Через 12 часов замените носитель двумя миллилитровами полной среды и инкубировать еще на 36 часов.
Через 36 часов проверьте маркеры флуоресценции. Урожай инфицированных клеток и смешать их в соотношении один к одному с окончательной концентрацией одного миллиона клеток на миллилитр. Центрифуга клетки в 110 раз G в течение пяти минут и повторно приостановить клеточной смеси в 50 микролитров инъекционного раствора.
После анестезии личинок зебры, перенесите их в инъекционной пластине, которая заполнена модифицированным E3. Возьмите 25 микролитров подвески смешанных клеток в микрокапильярной иглы и вставьте иглу в манипулятор микроинъекции. Установите давление и время инъекций и ввимите от 50 до 80 клеток в желточный мешок 48 часов после оплодотворения зебры. Во-первых, перенесите послезенотрансплантированные личинки зебры в 40 миллилитров раствора смеси при 32 градусах Цельсия.
Поместите 10 зенотрансплантированных личинок в каждый колодец из 12-хорошо пластины. Затем разделите личинки на четыре группы. Относитесь к контрольной группе с E3, содержащей 0,1%DMSO, и обработать другие группы гемцитабином и/или Navitoclax.
Инкубировать все личинки при 32 градусах по Цельсию в течение двух дней. После анестезии зенотрансплантированных личинок после лечения поместите их в 3%метил-целлюлозу. Используйте флуоресценцию или конфокальный микроскоп для изображения личинок с бокового вида.
Затем используйте программное обеспечение для панели изображений J и график для количественной оценки интенсивности красных и зеленых сигналов флуоресценции. В этом исследовании, первичные раковые клетки ткани посеяны в полной среде после пищеварения с или без добавления ингибиторов рака поджелудочной железы фибробластов. Раковые клетки и фибробласты обогащаются как две различные популяции.
Население без ингибиторов преобладают фибробласты в то время как рост раковых клеток преобладает после добавления ингибиторов. Построены два вектора лентивирусной упаковки, которые выражают зеленые или красные флуоресцентные белки в BCL2L1. Флуоресценция на основе вируса представляет собой состояние выживания клеток.
Смешанные раковые клетки и фибробласты вводятся в желточный мешок Зебрафиш в течение 48 часов после оплодотворения, а затем лечатся гемцитабином и/или Navitoclax в течение двух дней. Клеточной виабильности в различных популяциях и клеточного состава зенографта меняются в качестве ответов на лечение наркотиками. При обработке различных типов опухолей, Есть несколько шагов, которые, возможно, потребуется возразить, в том числе время пищеварения клеток, дозировка лечения наркотиков, и так далее.
Этот метод помогает исследователям использовать Зебрафиш из стандартного анализа CGX или PDS. Это позволяет смешивать и инъекции различных клеток при фиксированных соотношениях для количественной оценки прогресса полос, сравнивая их с ростом клеток. Личная защита имеет большое значение, особенно при упаковке лентивируса.
Носите маски и перчатки, когда это необходимо и постарайтесь не смешивать на коже.
