Hoje vamos introduzir um modelo PDX de zebrafish larvas. Este modelo é significativo porque eles podem imitar melhor uma composição celular semelhante no xenoenxerto para avaliar as respostas medicamentosas e também melhora ainda mais a consistência dos resultados com nossa análise comparativa. Há duas principais vantagens dessa técnica.
Em primeiro lugar, usamos vários corantes químicos padrão para rotular as células em diferentes fluorescências, permitindo o rastreamento em tempo real das composições celulares e a capacidade da fase anagrafo. Em segundo lugar, também melhora o tempo geral de sobrevivência das células humanas em zebrafish, sua modificação genética, que fornece uma janela de observação mais longa para testes de drogas. Esta técnica fornece um modelo potencial para a medicina personalizada para pacientes com câncer de pâncreas e também para a pré-avaliação de medicamentos tumorais pré-clínicos.
Este método também pode ser usado para rastrear outras células tumorais ou nenhuma célula tumoral xenergrafada em zebrafish in vivo e para melhorar a sobrevivência celular por mais tempo de observação. Para preparar a placa de injeção, prepare uma solução de 50 mililitros de 1%agarose na solução E3. Ferva a solução até que a ágarose se dissolva.
Despeje toda a solução em uma placa de Petri de 10 centímetros e, em seguida, coloque o molde de fixação de embrião zebrafish sobre a superfície. Quando a solução agarose se solidificar completamente, remova o molde. Para preparar agulhas de injeção, use um puxador de agulhas para puxar um capilar de vidro de 10 centímetros com uma dimensão interna de 0,9 milímetros em duas agulhas.
Usando um microscópio e fórceps, corte a ponta da agulha para criar uma abertura. Primeiro, coloque de um a dois pares de zebrafish adultos em um tanque de acasalamento por volta das 19:00. Às oito da manhã seguinte, recolhe os óvulos fertilizados. Transfira os ovos fertilizados para uma placa de Petri contendo 40 mililitros de solução E3 fresca.
Incubar a 28,5 graus Celsius. Primeiro, transfira a amostra de câncer de pâncreas coletada em uma placa de Petri. Enxágüe o tecido cinco a seis vezes com PBS e use um bisturi para cortar o tecido em pedaços cubos de um milímetro.
Em seguida, transfira o tecido desfiado para um tubo de 50 mililitros contendo cinco mililitros de HBSS. Adicione colagenase tipo quatro, hialurodinase e DNAse um nas concentrações finais mostradas aqui. Pipeta a mistura para cima e para baixo para misturar bem.
Incubar a mistura a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% por 15 a 20 minutos. Pipeta a mistura para cima e para baixo algumas vezes a cada cinco minutos. Adicione sete mililitros de DMEM ao tubo.
Centrifugar a 110 vezes G e a 4 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, decante o supernasal e suspenda novamente a mistura tumoral no DMEM. Emplaque a mistura em duas placas de Petri de seis centímetros contendo três mililitros de mídia de crescimento total chamada grupo um e grupo dois.
Incubar ambos os grupos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Após 48 horas, adicione 100x inibidor de fibroblastos de câncer de pâncreas no meio do grupo um para remover os fibroblastos crescidos, deixando as células cancerosas como os principais tipos celulares. Continue incubando usando as condições anteriores.
Após a produção do lentivírus, semeou as células para serem infectadas em uma placa de 12 poços com densidade de 30 a 40%. Cultura as células durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. No dia seguinte, substitua o meio por 500 microliters de meio livre de soro contendo polibreno a uma concentração de oito microgramas por mililitro.
Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por quatro horas. Em seguida, adicione mais 100 microliters do lentivírus ao meio e incuba novamente por 12 horas. Após 12 horas, substitua o meio por dois mililitros de meio completo e incubar por mais 36 horas.
Depois de 36 horas, verifique os marcadores de fluorescência. Colher as células infectadas e misturá-las em uma proporção de um para um com uma concentração final de um milhão de células por mililitro. Centrifugar as células a 110 vezes G durante cinco minutos e suspender a mistura celular em 50 microliters de solução de injeção.
Depois de anestesiar as larvas de zebrafish, transfira-as para a placa de injeção, que é preenchida com E3 modificado. Pegue 25 microliters da suspensão celular mista na agulha microcapilar e insira a agulha no manipulador de microinjeção. Defina a pressão e o tempo de injeção e injete de 50 a 80 células no saco de gema de 48 horas após a fertilização zebrafish. Primeiro, transfira as larvas de zebrafish pós-zenografadas em 40 mililitros de solução de mistura a 32 graus Celsius.
Coloque 10 larvas zenografadas em cada poço de uma placa de 12 poços. Em seguida, divida as larvas em quatro grupos. Trate o grupo controle com E3 contendo 0,1% DMSO e trate os outros grupos com Gemcitabina e/ou Navitoclax.
Incubar todas as larvas a 32 graus Celsius por dois dias. Depois de anestesiar as larvas zenografadas após o tratamento, coloque-as em celulose de 3%de metila. Use um microscópio de fluorescência ou confocal para visualizar as larvas a partir da visão lateral.
Em seguida, use o software de imagem J e gráfico pad para quantificar a intensidade dos sinais de fluorescência vermelha e verde. Neste estudo, as células do tecido do câncer primário são semeadas em meio completo após a digestão com ou sem a adição de inibidores de fibroblastos de câncer de pâncreas. Células cancerígenas e fibroblastos são enriquecidos como duas populações distintas.
A população sem inibidores é dominada por fibroblastos, enquanto o crescimento das células cancerosas prevalece após a adição de inibidores. São construídos dois vetores de embalagem lentiviral que expressam proteínas fluorescentes verdes ou vermelhas no BCL2L1. A rotulagem de fluorescência baseada em vírus representa o status de sobrevivência das células.
As células cancerígenas mistas e os fibroblastos são injetados no saco de gema zebrafish em 48 horas após a fertilização e são então tratados com Gemcitabina e/ou Navitoclax por dois dias. As viabilidades celulares em diferentes populações e a composição celular do zenoento são alteradas como respostas ao tratamento medicamentoso. Ao processar diferentes tipos de tumores, existem várias etapas que podem precisar ser contestadas, incluindo tempo de digestão celular, dosagem do tratamento medicamentoso, e assim por diante.
Essa técnica ajuda os pesquisadores a empregar zebrafish a partir de um ensaio padrão CGX ou PDS. Permite a mistura e injeção de diferentes células em proporções fixas para quantificar as bandas de progresso, comparando-as com o crescimento celular. A proteção pessoal é de grande importância, especialmente quando embala lentivírus.
Use máscaras e luvas quando apropriado e tente não misturar na pele.
