Oggi presenteremo un modello ZEBRAFISH PDX di larve. Questo modello è significativo perché possono imitare meglio una composizione cellulare simile nello xenograft per valutare le risposte ai farmaci e migliorano ulteriormente la coerenza dei risultati con la nostra analisi comparativa. Ci sono due vantaggi principali di questa tecnica.
In primo luogo, utilizziamo vari coloranti chimici standard per etichettare le cellule in diversa fluorescenza, consentendo il tracciamento in tempo reale delle composizioni cellulari e la capacità della fase anagrafica. In secondo luogo, migliora anche il tempo generale di sopravvivenza delle cellule umane nei pesci zebra, la loro modificazione genetica, che fornisce una finestra di osservazione più lunga per i test farmacologici. Questa tecnica fornisce un potenziale modello per la medicina personalizzata per i pazienti con cancro al pancreas e anche per la pre-valutazione del farmaco tumorale pre-clinico.
Questo metodo può anche essere utilizzato per rintracciare altre cellule tumorali o nessuna cellula tumorale xenografata in zebrafish in vivo e per migliorare la sopravvivenza cellulare per un tempo di osservazione più lungo. Per preparare la piastra di iniezione, preparare una soluzione da 50 millilitri dell'1%agarosio in soluzione E3. Far bollire la soluzione fino a quando l'agarosio si dissolve.
Versare l'intera soluzione in una piastra di Petri di 10 centimetri e quindi posizionare lo stampo di fissazione dell'embrione Zebrafish sulla superficie. Quando la soluzione di agarosio si solidifica completamente, rimuovere lo stampo. Per preparare gli aghi di iniezione, utilizzare un estrattore di ago per tirare un capillare di vetro di 10 centimetri con una dimensione interna di 0,9 millimetri in due aghi.
Utilizzando un microscopio e pini, tagliare l'estremità dell'ago per creare un'apertura. Per prima cosa, metti da una a due paia di Zebrafish adulti in un serbatoio di accoppiamento intorno alle 19:00. Alle otto del mattino successivo, raccogli le uova fecondate. Trasferire le uova fecondate in una piastra di Petri contenente 40 millilitri di soluzione E3 fresca.
Incubare a 28,5 gradi Celsius. In primo luogo, trasferire il campione di cancro al pancreas raccolto in una piastra di Petri. Risciacquare il tessuto da cinque a sei volte con PBS e utilizzare un bisturi per tagliare il tessuto in pezzi a cubetti di un millimetro.
Successivamente, trasferire il tessuto triturato in un tubo da 50 millilitri contenente cinque millilitri di HBSS. Aggiungere collagenasi di tipo quattro, ialurodinasi e DNAsi uno alle concentrazioni finali mostrate qui. Pipettare la miscela su e giù per mescolare bene.
Incubare la miscela a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica del 5% per 15-20 minuti. Pipettare la miscela su e giù un paio di volte ogni cinque minuti. Aggiungere sette millilitri di DMEM al tubo.
Centrifuga a 110 volte G e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, decantare il supernatante e sospendere di nuovo la miscela tumorale in DMEM. Placcare la miscela in due piastre di Petri di sei centimetri contenenti tre millilitri di mezzi di crescita completi denominati gruppo uno e gruppo due.
Incubare entrambi i gruppi a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Dopo 48 ore, aggiungere 100x inibitore dei fibroblasti del cancro al pancreas nel mezzo del primo gruppo per rimuovere i fibroblasti ricoperti di vegetazione, lasciando le cellule tumorali come i principali tipi di cellule. Continuare a incubare utilizzando le condizioni precedenti.
Dopo aver prodotto il lentivirus, seminare le cellule da infettare in una piastra da 12 po 'con una densità dal 30 al 40%. Coltura delle cellule durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con 500 microlitri di mezzo privo di siero contenente polibrene ad una concentrazione di otto microgrammi per millilitro.
Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per quattro ore. Quindi, aggiungere altri 100 microlitri del lentivirus al mezzo e incubare di nuovo per 12 ore. Dopo 12 ore, sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo completo e incubare per altre 36 ore.
Dopo 36 ore, controllare i marcatori di fluorescenza. Raccogliere le cellule infette e mescolarle con un rapporto uno a uno con una concentrazione finale di un milione di cellule per millilitro. Centrifugare le cellule a 110 volte G per cinque minuti e sospendere di nuovo la miscela cellulare in 50 microlitri di soluzione di iniezione.
Dopo aver anestetizzato le larve di Zebrafish, trasferirle nella piastra di iniezione, che viene riempita con E3 modificata. Prendere 25 microlitri della sospensione a celle miste nell'ago microcapillare e inserire l'ago nel manipolatore di microiniezione. Impostare la pressione e il tempo di iniezione e iniettare da 50 a 80 cellule nel sacco vitellino di 48 ore dopo la fecondazione Zebrafish. In primo luogo, trasferire le larve di Zebrafish post-zenografate in 40 millilitri di soluzione di mix a 32 gradi Celsius.
Posizionare 10 larve zenografate in ogni pozzo di un piatto di 12 po '. Successivamente, dividi le larve in quattro gruppi. Trattare il gruppo di controllo con E3 contenente lo 0,1%DMSO e trattare gli altri gruppi con Gemcitabina e/o Navitoclax.
Incubare tutte le larve a 32 gradi Celsius per due giorni. Dopo aver anestetizzato le larve zenografate dopo il trattamento, mettile in cellulosa metile al 3%.. Utilizzare una fluorescenza o un microscopio confocale per immagini le larve dalla vista laterale.
Quindi, utilizzare il software image J e graph pad per quantificare l'intensità dei segnali di fluorescenza rossi e verdi. In questo studio, le cellule primarie del tessuto tumorale vengono sementi in mezzo completo dopo la digestione con o senza l'aggiunta di inibitori dei fibroblasti del cancro al pancreas. Le cellule tumorali e i fibroblasti sono arricchiti come due popolazioni distinte.
La popolazione senza inibitori è dominata dai fibroblasti mentre prevale la crescita delle cellule tumorali dopo l'aggiunta di inibitori. Sono costruiti due vettori di imballaggio lentivirale che esprimono proteine fluorescenti verdi o rosse in BCL2L1. L'etichettatura a fluorescenza a base di virus rappresenta lo stato di sopravvivenza delle cellule.
Le cellule tumorali miste e i fibroblasti vengono iniettati nel sacco tuorlo Zebrafish a 48 ore dopo la fecondazione e quindi trattati con Gemcitabina e/o Navitoclax per due giorni. Le viabilità cellulari in diverse popolazioni e la composizione cellulare dello zenograft sono cambiate come risposte al trattamento farmacologico. Quando si elaborano diversi tipi di tumori, ci sono diversi passaggi che potrebbero dover essere oggettivati, tra cui il tempo di digestione cellulare, il dosaggio del trattamento farmacologico e così via.
Questa tecnica aiuta i ricercatori ad utilizzare Zebrafish da un saggio CGX o PDS standard. Consente la miscelazione e l'iniezione di diverse cellule a rapporti fissi per quantificare le bande di avanzamento confrontandole con la crescita cellulare. La protezione personale è di grande importanza, specialmente quando si confeziona il lentivirus.
Indossare maschere e guanti quando appropriato e cercare di non mescolare sulla pelle.
