Aujourd’hui, nous allons introduire une larve Zebrafish PDX Model. Ce modèle est significatif parce qu’ils peuvent mieux imiter une composition cellulaire semblable dans la xénogreffe pour évaluer des réponses de drogue et améliorent également davantage la cohérence des résultats avec notre analyse comparative. Il y a deux principaux avantages de cette technique.
Tout d’abord, nous utilisons divers colorants chimiques standard pour étiqueter les cellules en fluorescence différente, permettant le traçage en temps réel des compositions cellulaires et la capacité de la phase anagraphique. Deuxièmement, il améliore également le temps de survie général des cellules humaines chez le poisson zèbre, leur modification génétique, qui fournit une fenêtre d’observation plus longue pour le dépistage des drogues. Cette technique fournit un modèle potentiel pour la médecine personnalisée pour des patients présentant le cancer pancréatique et également pour la pré-évaluation du médicament préclinique de tumeur.
Cette méthode peut également être utilisée pour tracer d’autres cellules tumorales ou pas de cellule tumorale xénogreffe dans zebrafish in vivo et pour améliorer la survie cellulaire pour un temps d’observation plus long. Pour préparer la plaque d’injection, préparer une solution de 50 millilitres de 1% agarose dans la solution E3. Faire bouillir la solution jusqu’à ce que l’agarose se dissolve.
Verser toute la solution dans une boîte de Pétri de 10 centimètres, puis placer le moule de fixation embryon Zebrafish sur la surface. Lorsque la solution agarose se solidifie complètement, enlever le moule. Pour préparer les aiguilles d’injection, utilisez un tire-aiguille pour tirer un capillaire en verre de 10 centimètres avec une dimension intérieure de 0,9 millimètre en deux aiguilles.
À l’aide d’un microscope et de forceps, couper l’extrémité de l’aiguille pour créer une ouverture. Tout d’abord, placez une à deux paires de poisson zèbre adulte dans un réservoir d’accouplement vers 19 h à neuf heures. À huit heures du matin le lendemain matin, recueillir les œufs fécondés. Transférer les œufs fertilisés dans une boîte de Pétri contenant 40 millilitres de solution E3 fraîche.
Incuber à 28,5 degrés Celsius. Tout d’abord, transférer l’échantillon de cancer du pancréas recueilli dans une boîte de Pétri. Rincez le tissu cinq à six fois avec PBS et utilisez un scalpel pour couper le tissu en un millimètre en cubes.
Ensuite, transférez le tissu déchiqueté dans un tube de 50 millilitres contenant cinq millilitres de HBSS. Ajoutez collagène type quatre, hyalurodinase, et DNAse un aux concentrations finales montrées ici. Pipette le mélange de haut en bas pour bien mélanger.
Incuber le mélange à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % pendant 15 à 20 minutes. Pipette le mélange de haut en bas à quelques reprises toutes les cinq minutes. Ajouter sept millilitres de DMEM au tube.
Centrifugeuse à 110 fois G et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis, décanter le supernatant et re-suspendre le mélange tumoral dans DMEM. Plaquez le mélange en deux boîtes de Petri de six centimètres contenant trois millilitres de supports de croissance complète nommés groupe un et groupe deux.
Incuber les deux groupes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 %. Après 48 heures, ajouter 100x inhibiteur des fibroblastes du cancer du pancréas dans le milieu du groupe un pour enlever les fibroblastes envahis, laissant les cellules cancéreuses comme les principaux types de cellules. Continuez à couver en utilisant les conditions précédentes.
Après avoir produit le lentivirus, ensemencer les cellules à infecter dans une plaque de 12 puits avec une densité de 30 à 40%. Culture des cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5%. Le lendemain, remplacer le milieu par 500 microlitres de milieu sans sérum contenant du polybrene à une concentration de huit microgrammes par millilitre.
Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant quatre heures. Ensuite, ajoutez 100 microlitres supplémentaires du lentivirus au milieu et incubez à nouveau pendant 12 heures. Après 12 heures, remplacer le milieu par deux millilitres de milieu complet et incuber pendant 36 heures supplémentaires.
Après 36 heures, vérifiez les marqueurs de fluorescence. Récoltez les cellules infectées et mélangez-les à un rapport un pour un avec une concentration finale d’un million de cellules par millilitre. Centrifugez les cellules à 110 fois G pendant cinq minutes et suspendez le mélange cellulaire dans 50 microlitres de solution d’injection.
Après anesthésier les larves de poisson zèbre, transférez-les dans la plaque d’injection, qui est remplie d’E3 modifié. Prenez 25 microlitres de la suspension à cellules mixtes dans l’aiguille microcapillaire et insérez l’aiguille dans le manipulateur de microinjection. Réglez la pression et le temps d’injection et injectez 50 à 80 cellules dans le sac jaune de 48 heures après la fécondation Zebrafish. Tout d’abord, transférez les larves de poisson zèbre post-zenografted en 40 millilitres de solution de mélange à 32 degrés Celsius.
Placer 10 larves zenografted dans chaque puits d’une plaque de 12 puits. Ensuite, divisez les larves en quatre groupes. Traitez le groupe témoin avec l’E3 contenant 0,1% DMSO et traitez les autres groupes avec gemcitabine et/ou Navitoclax.
Incuber toutes les larves à 32 degrés Celsius pendant deux jours. Après avoir anesthésié les larves zenografted après le traitement, placez-les dans 3% de cellulose méthyle. Utilisez une fluorescence ou un microscope confocal pour visualiser les larves de la vue latérale.
Ensuite, utilisez le logiciel d’image J et de tapis graphique pour quantifier l’intensité des signaux de fluorescence rouge et vert. Dans cette étude, les cellules primaires de tissu de cancer sont ensemencées dans le milieu complet après digestion avec ou sans l’addition des inhibiteurs de fibroblastes pancréatiques de cancer. Les cellules cancéreuses et les fibroblastes sont enrichis en deux populations distinctes.
La population sans inhibiteurs est dominée par les fibroblastes tandis que la croissance des cellules cancéreuses prévaut après l’ajout d’inhibiteurs. Deux vecteurs d’emballage lentiviral sont construits qui expriment des protéines fluorescentes vertes ou rouges dans BCL2L1. L’étiquetage de fluorescence à base de virus représente l’état de survie des cellules.
Les cellules cancéreuses mixtes et les fibroblastes sont injectés dans le sac de jaune de poisson zèbre à 48 heures après la fécondation et sont ensuite traités avec gemcitabine et / ou Navitoclax pendant deux jours. Les viabilities cellulaires dans différentes populations et la composition cellulaire de la zenograft sont changées pendant que les réponses au traitement de drogue. Lors du traitement de différents types de tumeurs, il ya plusieurs étapes qui peuvent avoir besoin d’être objecté, y compris le temps de digestion cellulaire, dosage de traitement médicamenteux, et ainsi de suite.
Cette technique aide les chercheurs à utiliser zebrafish à partir d’un test standard CGX ou PDS. Il permet le mélange et l’injection de différentes cellules à des ratios fixes pour quantifier les bandes de progression en les comparant à la croissance cellulaire. La protection personnelle est d’une grande importance, en particulier lorsque l’emballage lentivirus.
Portez des masques et des gants le cas échéant et essayez de ne pas mélanger sur la peau.
