Heute werden wir eine Larven Zebrafish PDX Modell vorstellen. Dieses Modell ist wichtig, weil sie eine ähnliche Zellzusammensetzung im Xenograft zur Beurteilung von Arzneimittelreaktionen besser imitieren können und auch die Konsistenz der Ergebnisse mit unserer vergleichenden Analyse weiter verbessern. Es gibt zwei Hauptvorteile dieser Technik.
Erstens verwenden wir verschiedene chemische Standardfarbstoffe, um Zellen in verschiedene Fluoreszenz zu kennzeichnen, was die Echtzeitverfolgung der zellulären Zusammensetzungen und die Fähigkeit der Anagraphenphase ermöglicht. Zweitens verbessert es auch die allgemeine Überlebenszeit menschlicher Zellen in Zebrafischen, ihre genetische Veränderung, die ein längeres Beobachtungsfenster für Drogentests bietet. Diese Technik bietet ein mögliches Modell für die personalisierte Medizin für Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs und auch für die Vorbewertung von präklinischen Tumormedikamenten.
Diese Methode kann auch verwendet werden, um andere Tumorzellen oder keine Tumorzelle xenografted in Zebrafischen in vivo zu verfolgen und das Zellüberleben für längere Beobachtungszeit zu verbessern. Zur Vorbereitung der Injektionsplatte eine 50-Milliliter-Lösung von 1%Agarose in E3-Lösung vorzubereiten. Die Lösung aufkochen, bis sich die Agarose auflöst.
Gießen Sie die gesamte Lösung in eine 10 Zentimeter Petrischale und legen Sie dann die Zebrafisch-Embryo-Fixierungsform auf die Oberfläche. Wenn die Agarose-Lösung vollständig verfestigt ist, entfernen Sie die Form. Um Injektionsnadeln vorzubereiten, ziehen Sie mit einem Nadelzieher eine 10 Zentimeter lange Glaskapillare mit einer innengroßen Dimension von 0,9 Millimetern in zwei Nadeln.
Schneiden Sie mit einem Mikroskop und einer Zange das Ende der Nadel, um eine Öffnung zu erzeugen. Legen Sie zunächst ein bis zwei Paare erwachsener Zebrafische gegen sieben bis um neun Uhr in einen Paarungsbecken. Um acht Uhr am nächsten Morgen die befruchteten Eier sammeln. Die befruchteten Eier in eine Petrischale mit 40 Milliliter frischer E3-Lösung geben.
Bei 28,5 Grad Celsius inkubieren. Übertragen Sie zunächst die gesammelte Bauchspeicheldrüsenkrebsprobe in eine Petrischale. Spülen Sie das Gewebe fünf- bis sechsmal mit PBS und verwenden Sie ein Skalpell, um das Gewebe in einen Millimeter gewürfelte Stücke zu schneiden.
Als nächstes übertragen Sie das geschredderte Gewebe in eine 50-Milliliter-Röhre mit fünf Millilitern HBSS. Fügen Sie Kollagenase Typ 4, Hyalurodinase und DNAse eins bei den letzten Hiergezeigten konzentrationen hinzu. Pipette die Mischung nach oben und unten gut mischen.
Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator für 15 bis 20 Minuten. Pipette die Mischung auf und ab ein paar Mal alle fünf Minuten. Fügen Sie sieben Milliliter DMEM in die Röhre.
Zentrifuge bei 110 mal G und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Dekantieren Sie dann den Überstand und setzen Sie die Tumormischung in DMEM erneut aus. Die Mischung in zwei sechs Zentimeter lange Petrischalen mit drei Millilitern Vollwachstumsmedien namens Gruppe eins und Gruppe zwei geben.
Inkubieren Sie beide Gruppen bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator. Nach 48 Stunden, fügen Sie 100x Inhibitor der Bauchspeicheldrüsenkrebs Fibroblasten in das Medium der Gruppe eins, um die überwucherten Fibroblasten zu entfernen, so dass die Krebszellen als die wichtigsten Zelltypen. Fahren Sie mit den vorherigen Bedingungen fort.
Nach der Herstellung des Lentivirus, Samen die Zellen in eine 12-Well-Platte mit 30 bis 40% Dichte infiziert werden. Kultur die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch 500 Mikroliter serumfreies Medium, das Polybren in einer Konzentration von acht Mikrogramm pro Milliliter enthält.
Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für vier Stunden inkubieren. Dann fügen Sie weitere 100 Mikroliter des Lentivirus in das Medium und brüten wieder für 12 Stunden. Nach 12 Stunden das Medium durch zwei Milliliter komplettes Medium ersetzen und für weitere 36 Stunden inkubieren.
Überprüfen Sie nach 36 Stunden die Fluoreszenzmarker. Ernten Sie die infizierten Zellen und mischen Sie sie im Eins-zu-Eins-Verhältnis mit einer Endkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 110 mal G für fünf Minuten und setzen Sie das Zellgemisch in 50 Mikroliter Injektionslösung wieder auf.
Nach der Anästhesisierung der Zebrafischlarven in die Injektionsplatte, die mit modifiziertem E3 gefüllt ist, geben. Nehmen Sie 25 Mikroliter der gemischtzelligen Suspension in die Mikrokapillarnadel auf und legen Sie die Nadel in den Mikroinjektionsmanipulator ein. Stellen Sie den Injektionsdruck und die Zeit ein und injizieren Sie 50 bis 80 Zellen in den Dottersack von 48 Stunden nach der Befruchtung Zebrafische. Zuerst übertragen Sie die nachzenografierten Zebrafischlarven in 40 Milliliter Mischlösung bei 32 Grad Celsius.
Legen Sie 10 zenografierte Larven in jeden Brunnen einer 12-Well-Platte. Als nächstes teilen Sie die Larven in vier Gruppen. Behandeln Sie die Kontrollgruppe mit E3 mit 0,1%DMSO und behandeln Sie die anderen Gruppen mit Gemcitabin und/oder Navitoclax.
Alle Larven zwei Tage lang bei 32 Grad Celsius bebrüten. Nach der Anästhesisierung der zenotransplantierten Larven nach der Behandlung in 3%Methylcellulose geben. Verwenden Sie ein Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop, um die Larven aus der seitlichen Ansicht abzubilden.
Verwenden Sie dann Bild J und Graphpad-Software, um die Intensität von roten und grünen Fluoreszenzsignalen zu quantifizieren. In dieser Studie werden primäre Krebsgewebezellen nach der Verdauung mit oder ohne Zugabe von Pankreaskrebs-Fibroblasten-Inhibitoren in ein vollständiges Medium ausgesät. Krebszellen und Fibroblasten werden als zwei verschiedene Populationen angereichert.
Die Population ohne Inhibitoren wird von Fibroblasten dominiert, während das Wachstum von Krebszellen nach der Zugabe von Inhibitoren vorherrscht. Es werden zwei lentivirale Verpackungsvektoren konstruiert, die grüne oder rote fluoreszierende Proteine in BCL2L1 ausdrücken. Die virusbasierte Fluoreszenzkennzeichnung stellt den Überlebensstatus der Zellen dar.
Die gemischten Krebszellen und Fibroblasten werden nach 48 Stunden nach der Befruchtung in den Zebrafisch-Dottersack injiziert und anschließend zwei Tage lang mit Gemcitabin und/oder Navitoclax behandelt. Die Zellviabilitäten in verschiedenen Populationen und die zelluläre Zusammensetzung des Zenografts werden als Reaktionen auf die medikamentöse Behandlung verändert. Bei der Verarbeitung verschiedener Arten von Tumoren, Es gibt mehrere Schritte, die möglicherweise beanstandet werden müssen, einschließlich der Zellverdauungszeit, Dosierung der medikamentösen Behandlung, und so weiter.
Diese Technik hilft Forschern, Zebrafische aus einem Standard-CGX- oder PDS-Assay zu verwenden. Es ermöglicht die Mischung und Injektion verschiedener Zellen in festen Verhältnissen, um die Fortschrittsbänder zu quantifizieren, indem sie mit dem Zellwachstum verglichen werden. Persönlicher Schutz ist von großer Bedeutung, vor allem bei der Verpackung lentivirus.
Tragen Sie Masken und Handschuhe, wenn dies angebracht ist, und versuchen Sie nicht, auf der Haut zu mischen.
