今日は幼虫ゼブラフィッシュPDXモデルを紹介します。このモデルは、薬物応答を評価するための異種移植片の同様の細胞組成をよりよく模倣し、比較分析による結果の一貫性をさらに向上させることができるため、重要です。この手法には、主に 2 つの利点があります。
まず、さまざまな標準的な化学染料を使用して細胞を異なる蛍光に標識し、細胞組成のリアルタイムトレースとアナグラフ段階の能力を可能にします。第二に、それはまた、ゼブラフィッシュのヒト細胞の一般的な生存時間を改善し、その遺伝子改変は、薬物検査のためのより長い観察ウィンドウを提供する。この技術は、膵臓癌患者のためのパーソナライズされた医療のための潜在的なモデルを提供し、また、前臨床腫瘍薬の事前評価のために。
この方法はまた、生体内のゼブラフィッシュに異種化された他の腫瘍細胞または全く腫瘍細胞を追跡し、より長い観察時間のために細胞生存率を改善するために使用することができる。注入プレートを調製するには、E3溶液に1%アガロースの50ミリリットル溶液を調製する。アガロースが溶けるまで溶液を沸騰させます。
溶液全体を10センチメートルのペトリ皿に注ぎ、ゼブラフィッシュ胚固定金型を表面に置きます。アガロース溶液が完全に固まったら、金型を取り除きます。注射針を準備するには、針の引き手を使用して、0.9ミリメートルの内側の寸法の10センチメートルのガラス毛細血管を2本の針に引き出します。
顕微鏡と鉗子を使用して、針の端を切って開口部を作ります。まず、午後7時から9時頃に1~2足の成体ゼブラフィッシュを交配タンクに入れます。翌朝8時に受精卵を採取する。受精卵を40ミリリットルの新鮮なE3溶液を含むペトリ皿に移します。
摂氏28.5度でインキュベートします。まず、採取した膵臓癌サンプルをペトリ皿に移す。PBSで組織を5〜6回リンスし、メスを使用して組織を1ミリメートル立方体に切断します。
次に、細断された組織を5ミリリットルのHBSSを含む50ミリリットルのチューブに移す。コラゲターゼ4型、ヒアルロジナーゼ、およびDNAseを最終濃度で1つ追加します。よく混ぜるために上下に混合物をピペット。
5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cで15〜20分間インキュベートします。5分ごとに数回、混合物を上下にピペットします。チューブに7ミリリットルのDMEMを加えます。
110倍Gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。次いで、上清をデカントし、DMEMで腫瘍混合物を再懸濁する。グループ1とグループ2と名付けられた完全な成長培地の3ミリリットルを含む2つの6センチメートルペトリ皿に混合物をプレートします。
5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で両方のグループをインキュベートする。48時間後、膵臓癌線維芽細胞の100x阻害剤をグループ1の培地に加えて、生い茂った線維芽細胞を除去し、癌細胞を主要な細胞タイプとして残す。前の条件を使用してインキュベートを続けます。
レンチウイルスを産生した後、感染する細胞を30〜40%の密度の12ウェルプレートに播種する。5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で細胞を一晩培養する。翌日、ポリブレンを含む無血清培地500マイクロリットルの培地を1ミリリットル当たり8マイクログラムの濃度で交換する。
5%の二酸化炭素で摂氏37度で4時間インキュベートします。その後、レンチウイルスを100マイクロリットル追加して培地に加え、再び12時間インキュベートする。12時間後、培地を2ミリリットルの完全培地に交換し、さらに36時間インキュベートします。
36時間後、蛍光マーカーを確認してください。感染した細胞を収穫し、1ミリリットル当たり100万個の細胞の最終的な濃度で1対1の比率でそれらを混合します。細胞を110倍Gで5分間遠心し、50マイクロリットルの注入溶液で細胞混合物を再懸濁する。
ゼブラフィッシュの幼虫を麻酔した後、それらを注入プレートに移し、改変E3で満たします。混合細胞懸濁液の25マイクロリットルをマイクロキャピラリー針に取り込み、マイクロインジェクションマニピュレータに針を挿入します。注射圧力と時間を設定し、受精後48時間の黄身嚢に50〜80個の細胞を注入します。まず、ゼノグラフト後のゼブラフィッシュの幼虫を摂氏32度で40ミリリットルの混合溶液に移します。
ゼノ移植した幼虫を12ウェルプレートの各ウェルに10個入れる。次に、幼虫を4つのグループに分けます。0.1%DMSOを含むE3でコントロールグループを扱い、ゲムシタビンおよび/またはナビトクラックスで他のグループを扱います。
すべての幼虫を摂氏32度で2日間インキュベートする。ゼノ移植された幼虫を治療後に麻酔した後、3%メチルセルロースに入れる。蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、幼虫を横視から画像化します。
次に、画像Jとグラフパッドソフトウェアを使用して、赤と緑の蛍光信号の強度を定量化します。本研究では、原発癌組織細胞は、膵臓癌線維芽細胞阻害剤の添加の有無にかかわらず消化後に完全な培地に播種される。がん細胞と線維芽細胞は、2つの異なる集団として濃縮される。
阻害剤を含まない集団は線維芽細胞によって支配され、癌細胞の増殖は阻害剤の添加後に優勢である。BCL2L1で緑色または赤色の蛍光タンパク質を発現する2つのレンチウイルス包装ベクターが構築されています。ウイルスベースの蛍光標識は、細胞の生存状態を表す。
混合癌細胞と線維芽細胞は、受精後48時間でゼブラフィッシュ黄身嚢に注入され、その後、ゲムシタビンおよび/またはナビトクラックスで2日間治療される。ゼノ移植片の異なる集団および細胞組成における細胞の生存率は、薬物治療に対する応答として変化する。異なるタイプの腫瘍を処理する場合、細胞消化時間、薬物治療用量など、異議を唱える必要があるいくつかのステップがあります。
この技術は、研究者が標準的なCGXまたはPDSアッセイからゼブラフィッシュを採用するのに役立ちます。これは、細胞の成長と比較することによって進歩バンドを定量化するために、固定比率で異なる細胞の混合および注入を可能にする。個人保護は、特にレンチウイルスを包装する場合に非常に重要です。
適宜マスクと手袋を着用し、肌に混ぜないようにしてください。
