Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na transferência celular adotiva da célula T específica de antígeno viral derivada do iPSC para uma supressão eficaz da replicação do HBV em camundongos. A principal vantagem desta técnica é que as células T específicas de antígeno viral derivadas do iPSC têm um receptor de células T de um único tipo e fenótipo ingênuo. Para diferenciação de células T iPSC cd8-positivas específicas do HBV, placa s183 T receptor de células transduced iPSCs em uma monocamada OP9-DL1/DL4 em meio alfa-mínimo complementado com soro bovino 20% fetal e ligante murine Flt3 para sua co-cultura em uma incubadora de cultura celular.
Monitore a co-cultura regularmente para avaliar a morfologia celular. No dia 28, remova as células supernacantes e flutuantes, e desprende as células aderentes com 0,25% de trippsina. Quando as células tiverem levantado do fundo do recipiente de cultura, pare a reação enzimática com oito mililitros do meio iPSC e colete as células por centrifugação.
Resuspend a pelota em 10 mililitros de meio fresco. Diluir as células para uma célula T CD8-positiva derivada do iPSC para quatro s183 peptídeo-pulsed splenocyte razão para uma incubação de 40 horas na incubadora de cultura celular. Durante as últimas sete horas, adicione quatro microliters de brefeldin diluído A à cultura, para bloquear os processos de transporte durante a ativação celular.
Manche as células para análise citométrica de fluxo das citocinas intracelulares de interesse de acordo com os protocolos padrão. Para a entrega plasmida de HBV hidrodinâmica através da veia traseira, diluir 10 microgramas de HBV plasmid em um equivalente de 8% da massa corporal de PBS. Carregue o plasmídeo em uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de 26 bitolas e 1/2 polegada por mouse.
Aqueça os ratos de HHD sob uma lâmpada de calor por cinco minutos para dilatar as veias da cauda e puxe cuidadosamente um rato em um conterrante plástico. Localize uma veia traseira lateral dilatada no terço médio da cauda, e insira a agulha paralela à veia para entregar todo o volume de plasmídeo através da veia da cauda durante um período de três a cinco segundos. Para a transferência de células adoção de células T cd8-positivas derivadas de antígeno viral, colete as células T iPSC CD8-positivas no dia 22 da cultura, como demonstrado, e semee as células em um novo prato de cultura celular de 10 centímetros.
Após 30 minutos na incubadora de cultura celular, filtre as células flutuantes através de um coador de nylon de 70 micrômetros e conte as células viáveis. Diluir as células para um 1,5 vezes 10 para as sete células por mililitro de concentração de PBS. Injete 200 microliters de células em camundongos HHD individuais de quatro a seis semanas de idade, na veia da cauda como apenas demonstrado.
No dia 14, após a transferência celular, realize uma entrega plasmida de HBV hidrodinâmico como demonstrado. Nos pontos finais experimentais apropriados pós-infecção, colhia o fígado de cada animal infectado, e corte os fígados em amostras de tecido de 0,5 por 0,5 por 0,3 centímetros. Coloque as amostras em formalina tampão 10% neutra por quatro a 24 horas, seguida de decalcificação em ácido fórmico de 2,5 molar por seis a 24 horas.
Em seguida, enxágue as amostras em xileno por três minutos, seguido por duas enxaguas de dois minutos em 100% etanol, 95% etanol e água deionizada. Após a última lavagem de água, decalcifique os tecidos em EDTA de um mililitro a 90 graus Celsius, seguido por uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. Quando o tecido tiver esfriado, enxágue as amostras em PBS por quatro minutos e use xileno e etanol para desparafinar e reidratar as amostras.
Para rotulagem imunofluorescente, colora as seções com 200 microliters de anticorpo específico de antígeno da superfície HBV por duas horas à temperatura ambiente em uma câmara de 75 a 100% umidificada. No final da incubação, lave as amostras com cinco lavagens de cinco minutos em PBS fresco para cada lavagem. Rotule as células com DAPI de acordo com os protocolos padrão antes de montar os slides com tampas para imagem por microscopia de fluorescência.
Para análise imunohistoquímica, colorir as seções com hematoxilina e eosina de acordo com os protocolos padrão, e avaliar a infiltração de células inflamatórias no fígado por microscopia leve. A análise citométrica de fluxo da população CD8-positive derivada do IPSC revela que a transdução do receptor de células HBV T aumenta drasticamente a geração de células T cD8-positivas específicas do SPSC. Após a estimulação com esplenócitos t-esgotados pulsados com peptídeo s183, as células T derivadas do CD8 CD8 single-positive iPSC produzem grandes quantidades de gamma interferon, detectadas pela análise citométrica de fluxo intracelular e ELISA.
Após a infecção pelo HBV por injeção hidrodinâmica, a replicação do DNA atinge o pico no sexto dia e reduz gradualmente, como observado pela análise pcr em tempo real. Além disso, a replicação viral é significativamente reduzida em todos os pontos de tempo em camundongos que recebem células T específicas antigênicas do HBV em comparação com camundongos que recebem células de controle. A proteína superficial HBV também é substancialmente diminuída em camundongos que recebem linfócitos citotóxicos pré-iPSC específicos do IPSC do HBV em comparação com camundongos tratados com células de controle, demonstrando claramente que as células T iPSC cd8 positivas específicas do antígeno viral têm a capacidade de reduzir a replicação do HBV em um modelo murino.
Agora você deve ter uma boa compreensão de como gerar células T específicas de antígeno viral a partir de iPSC para imunoterapia adotiva.
