Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel trasferimento cellulare adottivo di cellule T specifiche dell'antigene virale derivate da iPSC per una soppressione efficace della replicazione HBV nei topi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule T specifiche dell'antigene virale derivate dall'iPSC hanno un recettore delle cellule T di singolo tipo e un fenotipo ingenuo. Per la differenziazione delle cellule T positive iPSC CD8-positive dell'HBV, le lamiere s183 T receptor gene-transduced iPSCs su un monostrato OP9-DL1/DL4 in mezzo alfa-minimo integrato con siero bovino fetale al 20% e ligando murino Flt3 per la loro cocoltura in un incubatore di coltura cellulare.
Monitorare regolarmente la co-coltura per valutare la morfologia cellulare. Il giorno 28, rimuovere le celle supernatanti e galleggianti e scollegare le cellule aderenti con lo 0,25% di tripside. Quando le cellule si sono alzate dal fondo del contenitore di coltura, interrompere la reazione enzimatica con otto millilitri di mezzo iPSC e raccogliere le cellule per centrifugazione.
Resuspend il pellet in 10 millilitri di mezzo fresco. Diluire le cellule in una cellula T CD8-positiva derivata da iPSC a quattro splenociti pulsati da peptidi s183 per un'incubazione di 40 ore nell'incubatore di coltura cellulare. Nelle ultime sette ore, aggiungere quattro microlitri di brefeldina A diluita alla coltura, per bloccare i processi di trasporto durante l'attivazione cellulare.
Macchiare le cellule per l'analisi citometrica del flusso delle citochine intracellulari di interesse secondo protocolli standard. Per l'erogazione idrodinamica del plasmide HBV attraverso la vena della coda, diluire 10 microgrammi di plasmide HBV in un equivalente dell'8% della massa corporea di PBS. Caricare il plasmide in una siringa da tre millilitri dotata di un ago da 26 e 1/2 pollice per topo.
Riscaldare i topi HHD sotto una lampada termica per cinque minuti per dilatare le vene della coda e tirare con cura un topo in un limitatore di plastica. Individuare una vena laterale dilatata della coda nel terzo centrale della coda e inserire l'ago parallelo alla vena per fornire l'intero volume di plasmide attraverso la vena della coda per un periodo da tre a cinque secondi. Per il trasferimento cellulare adottivo della cellula T CD8-positive derivato da iPSC, derivato dall'antigene virale, raccogliere le cellule T cd8-positive iPSC il giorno 22 della coltura come dimostrato e seminare le cellule su un nuovo piatto di coltura cellulare di 10 centimetri.
Dopo 30 minuti nell'incubatore di coltura cellulare, filtrare le cellule galleggianti attraverso un colino di nylon da 70 micrometri e contare le cellule vitali. Diluire le cellule a un 1,5 per 10 alle sette cellule per millilitro di concentrazione di PBS. Iniettare 200 microlitri di cellule in singoli topi HHD di quattro o sei settimane, nella vena della coda come appena dimostrato.
Il giorno 14 dopo il trasferimento cellulare, eseguire un'erogazione idrodinamica di plasmide HBV come dimostrato. Agli endpoint sperimentali appropriati dopo l'infezione, raccogliere il fegato da ogni animale infetto e tagliare i fegati in campioni di tessuto da 0,5 per 0,5 per 0,3 centimetri. Mettere i campioni in formalina tampone neutra al 10% per quattro-24 ore, seguita da decalcificazione in acido formico 2,5 molare per sei-24 ore.
Successivamente, sciacquare i campioni in xilene per tre minuti, seguiti da due risciacqui di due minuti in etanolo al 100%, 95% di etanolo e acqua deionizzata. Dopo l'ultimo lavaggio dell'acqua, decalcificare i tessuti in EDTA millimolare a 90 gradi Celsius, seguito da un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Quando il tessuto si è raffreddato, sciacquare i campioni in PBS per quattro minuti e utilizzare xilene ed etanolo per deparaffinizzare e reidratare i campioni.
Per l'etichettatura immunofluorescente, macchiare le sezioni con 200 microlitri di anticorpi specifici dell'antigene superficiale HBV per due ore a temperatura ambiente in una camera umidificata dal 75 al 100%. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con cinque lavaggi di cinque minuti in PBS fresco per ogni lavaggio. Etichettare le celle con DAPI secondo protocolli standard prima di montare le diapositive con coverlips per l'imaging mediante microscopia a fluorescenza.
Per l'analisi immunoistochimica, macchiare le sezioni con ematossilina ed eosina secondo protocolli standard e valutare l'infiltrazione di cellule infiammatorie nel fegato mediante microscopia ottica. L'analisi citometrica del flusso della popolazione CD8-positiva CD3-positiva derivata da iPSC rivela che la trasduzione del recettore cellulare HBV T aumenta drasticamente la generazione di cellule T cd8 positive virali specifiche di s183. Dopo la stimolazione con splenociti impoveriti a T pulsati con peptide s183, le cellule T mono-positive CD4-negative CD8 derivate da iPSC producono grandi quantità di gamma di interferone, come rilevato dall'analisi citometrica del flusso intracellulare e dall'ELISA.
Dopo l'infezione da HBV per iniezione idrodinamica, la replicazione del DNA raggiunge il sesto giorno e si riduce gradualmente, come osservato dall'analisi PCR in tempo reale. Inoltre, la replicazione virale è significativamente ridotta in tutti i punti di tempo nei topi che ricevono cellule T antigeniche virali HBV rispetto ai topi che ricevono cellule di controllo. La proteina superficiale HBV è anche notevolmente diminuita nei topi che ricevono linfociti citotossici pre-iPSC specifici dell'antigene virale HBV rispetto ai topi trattati con cellule di controllo, dimostrando chiaramente che le cellule T cd8 positive iPSC specifiche dell'antigene virale hanno la capacità di ridurre la replicazione dell'HBV in un modello murino.
Ora dovresti avere una buona comprensione di come generare cellule T specifiche dell'antigene virale da iPSC per l'immunoterapia adottiva.
