Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le transfert cellulaire adoptif de la cellule T virale dérivée de l’iPSC pour une suppression efficace de la réplication du VHB chez la souris. Le principal avantage de cette technique est que les cellules T virales iPSC-dérivées d’antigène ont un récepteur unique de cellule T de type et phénotype naïf. Pour la différenciation des lymphocytes T iPSC CD8-positifs spécifiques au VHB, plaque s183 récepteur des lymphocytes T iPSC induits par gène sur un monocouche OP9-DL1/DL4 en milieu alpha-minimum complété par 20% sérum bovin fœtal et murine Flt3 ligand pour leur co-culture dans un incubateur de culture cellulaire.
Surveillez régulièrement la co-culture pour évaluer la morphologie cellulaire. Le jour 28, enlever les cellules supernatantes et flottantes, et détacher les cellules adhérentes avec 0,25% trypsine. Lorsque les cellules se sont soulevées du fond du récipient de culture, arrêter la réaction enzymatique avec huit millilitres de milieu iPSC, et de recueillir les cellules par centrifugation.
Resuspendez la pastille en 10 millilitres de milieu frais. Diluer les cellules à une cellule T CD8-positive dérivée de l’iPSC à quatre s183 rapport peptidique-pulsé de splenocyte pour une incubation de 40 heures dans l’incubateur de culture cellulaire. Au cours des sept dernières heures, ajouter quatre microlitres de brefeldine diluée A à la culture, pour bloquer les processus de transport pendant l’activation cellulaire.
Tacher les cellules pour l’analyse cytométrique de flux des cytokines intracellulaires d’intérêt selon les protocoles standard. Pour l’administration hydrodynamique de plasmide de VHB par la veine de queue, diluer 10 microgrammes de plasmide de VHB dans un équivalent de 8% de la masse corporelle de PBS. Chargez le plasmide dans une seringue de trois millilitres munie d’une aiguille de 26 jauges et de 1/2 pouce par souris.
Chauffer les souris HHD sous une lampe thermique pendant cinq minutes pour dilater les veines de la queue, et tirer soigneusement une souris dans un restrainer en plastique. Localisez une veine latérale dilatée de la queue au milieu du tiers de la queue et insérez l’aiguille parallèlement à la veine pour livrer tout le volume de plasmide dans la veine de la queue sur une période de trois à cinq secondes. Pour le transfert viral de cellules adoptives cd8-positives dérivées de l’iPSC, recueillez les lymphocytes T CD8-positifs iPSC le jour 22 de la culture comme démontré, et ensemencez les cellules sur un nouveau plat de culture cellulaire de 10 centimètres.
Après 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire, filtrer les cellules flottantes à travers une passoire en nylon de 70 micromètres, et compter les cellules viables. Diluer les cellules à 1,5 fois 10 à sept cellules par millilitre de concentration de PBS. Injectez 200 microlitres de cellules dans des souris HHD individuelles de quatre à six semaines, dans la veine de la queue comme nous venons de le démontrer.
Le jour 14 après transfert cellulaire, effectuer une livraison hydrodynamique de plasmide de VHB comme démontré. Aux critères d’évaluation expérimentaux appropriés après l’infection, récoltez le foie de chaque animal infecté et coupez les foies en échantillons de tissus de 0,5 par 0,5 par 0,3 centimètre. Placez les échantillons dans de la formaline tampon neutre à 10 % pendant quatre à 24 heures, suivie de la décalcification en acide formique 2,5 molaire pendant six à 24 heures.
Ensuite, rincez les échantillons de xylène pendant trois minutes, suivis de deux rinçages de deux minutes à 100 % d’éthanol, 95 % d’éthanol et d’eau déionisée. Après le dernier lavage à l’eau, décalcifier les tissus en EDTA d’un millimolaire à 90 degrés Celsius, suivi d’une incubation de 30 minutes à température ambiante. Lorsque le tissu a refroidi, rincer les échantillons dans PBS pendant quatre minutes, et utiliser du xylène et de l’éthanol pour déparaffiner et réhydrater les échantillons.
Pour l’étiquetage immunofluorescent, tacher les sections avec 200 microlitres d’anticorps spécifiques aux antigènes de surface VHB pendant deux heures à température ambiante dans une chambre humidifiée à 75 à 100 %. À la fin de l’incubation, laver les échantillons avec cinq lavages de cinq minutes dans du PBS frais pour chaque lavage. Étiquetez les cellules avec DAPI selon les protocoles standard avant de monter les diapositives avec des coverslips pour l’imagerie par microscopie de fluorescence.
Pour l’analyse immunohistochimique, tacher les sections avec l’hématoxyline et l’éosine selon les protocoles standard, et évaluer l’infiltration des cellules inflammatoires dans le foie par microscopie légère. L’analyse cytométrique de flux de la population CD8-positive CD8-positive iPSC-dérivée révèle que la transduction de récepteur de cellule T de HBV augmente considérablement la génération des cellules T CD8-positives s183-spécifiques virales. Après stimulation avec des splenocytes T-épuisés pulsés avec le peptide de s183, les lymphocytes T cd8 cd8 mono-positifs d’iPSC-dérivés produisent de grandes quantités d’interféron gamma, comme détecté par l’analyse cytométrique intracellulaire de flux et ELISA.
Après l’infection par le VHB par injection hydrodynamique, la réplication de l’ADN atteint des sommets le sixième jour et diminue graduellement, comme l’observe l’analyse pcr en temps réel. De plus, la réplication virale est considérablement réduite à tout moment chez les souris qui reçoivent des cellules T antigéniques virales antigéniques du VHB par rapport aux souris qui reçoivent des cellules témoins. La protéine de surface du VHB est également considérablement diminuée chez les souris qui reçoivent des lymphocytes cytotoxiques pré-iPSC spécifiques aux antigènes du VHB par rapport aux souris traitées avec des cellules témoins, ce qui démontre clairement que les lymphocytes T cd8-positifs iPSC spécifiques aux antigènes viraux ont la capacité de réduire la réplication du VHB dans un modèle murin.
Vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la façon de générer des cellules T virales spécifiques aux antigènes de l’iPSC pour l’immunothérapie adoptive.
