Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la transferencia celular adoptiva de células T específicas del antígeno viral derivadas de iPSC para la supresión efectiva de la replicación del VHB en ratones. La principal ventaja de esta técnica es que las células T específicas del antígeno viral derivadas de iPSC tienen un único receptor de células T de tipo y un fenotipo ingenuo. Para la diferenciación de células T positivas iPSC específicas del VHB, la placa s183 T receptor de células T transdujo iPSC en una monocapa OP9-DL1/DL4 en medio alfa-mínimo complementado con 20%suero bovino fetal y ligando murino Flt3 para su cocultivo en una incubadora de cultivo celular.
Supervise el co-cultivo regularmente para evaluar la morfología celular. En el día 28, retire las células sobrenadantes y flotantes, y separe las células adherentes con 0.25%trypsin. Cuando las células se hayan levantado del fondo del recipiente de cultivo, detenga la reacción enzimática con ocho mililitros de medio iPSC y recoja las células por centrifugación.
Resuspender el pellet en 10 mililitros de medio fresco. Diluir las células a una célula T positiva CD8 derivada de iPSC a cuatro splenocitos con péptido s183 para una incubación de 40 horas en la incubadora de cultivo celular. Durante las últimas siete horas, añadir cuatro microlitros de brefeldina diluida A al cultivo, para bloquear los procesos de transporte durante la activación celular.
Manchar las células para el análisis citométrico de flujo de las citoquinas intracelulares de interés de acuerdo con los protocolos estándar. Para el suministro hidrodinámico de plásmido del VHB a través de la vena de la cola, diluir 10 microgramos de plásmido del VHB en un 8% equivalente a la masa corporal de PBS. Cargue el plásmido en una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 26 y 1/2 pulgada por ratón.
Caliente los ratones HHD bajo una lámpara de calor durante cinco minutos para dilatar las venas de la cola, y tire cuidadosamente de un ratón en un limitador de plástico. Localice una vena de cola lateral dilatada en el tercio medio de la cola e inserte la aguja paralela a la vena para entregar todo el volumen de plásmido a través de la vena de la cola durante un período de tres a cinco segundos. Para la transferencia de células T positivas de CD8 de antígeno viral, recoja las células T CD8 positivas de iPSC el día 22 del cultivo como se ha demostrado, y sembrar las células en un nuevo plato de cultivo celular de 10 centímetros.
Después de 30 minutos en la incubadora de cultivo celular, filtrar las células flotantes a través de un colador de nylon de 70 micrómetros, y contar las células viables. Diluir las células a un 1,5 veces 10 a las siete células por mililitro de concentración de PBS. Inyecte 200 microlitros de células en ratones individuales de HHD de cuatro a seis semanas de edad, en la vena de la cola como se acaba de demostrar.
El día 14 después de la transferencia celular, realice una entrega hidrodinámica de plásmido del VHB como se ha demostrado. En los puntos finales experimentales apropiados después de la infección, cosechar el hígado de cada animal infectado, y cortar los hígados en muestras de tejido de 0,5 por 0,5 por 0,3 centímetros. Coloque las muestras en formalina tampón 10% neutro durante cuatro a 24 horas, seguida de descalcificación en ácido fórmico de 2,5 molar durante seis a 24 horas.
A continuación, enjuague las muestras en xileno durante tres minutos, seguido de dos enjuagues de dos minutos en 100%etanol, 95% etanol y agua desionizada. Después del último lavado con agua, descalcificar los tejidos en EDTA de un milimolar a 90 grados centígrados, seguido de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando el tejido se haya enfriado, enjuague las muestras en PBS durante cuatro minutos, y use xileno y etanol para desparafinar y rehidratar las muestras.
Para el etiquetado inmunofluorescente, manche las secciones con 200 microlitros de anticuerpos específicos del antígeno de superficie del VHB durante dos horas a temperatura ambiente en una cámara 75 a 100% humidificada. Al final de la incubación, lave las muestras con cinco lavados de cinco minutos en PBS fresco para cada lavado. Etiquete las células con DAPI de acuerdo con los protocolos estándar antes de montar las diapositivas con cubreobjetos para la toma de imágenes por microscopía de fluorescencia.
Para el análisis inmunohistoquímico, manar las secciones con hematoxilina y eosina de acuerdo con los protocolos estándar, y evaluar la infiltración de células inflamatorias en el hígado por microscopía de luz. El análisis citométrico de flujo de la población CD8 positiva CD8 positiva de iPSC revela que la transducción del receptor de células T del VHB aumenta drásticamente la generación de células T positivas de CD88 específicas de s183. Después de la estimulación con esplenocitos extenuados en T pulsadas con péptido s183, las células T derivadas de iPSC CD8 monopositiva CD8 cd4 producen grandes cantidades de interferón gamma, según lo detectado por el análisis citométrico de flujo intracelular y ELISA.
Después de la infección por VHB por inyección hidrodinámica, la replicación del ADN alcanza su punto máximo en el día seis y se reduce gradualmente, como se observa mediante el análisis de PCR en tiempo real. Además, la replicación viral se reduce significativamente en todos los puntos de tiempo en ratones que reciben células T específicas de antigénicos virales del VHB en comparación con los ratones que reciben células de control. La proteína superficial del VHB también se reduce sustancialmente en ratones que reciben linfocitos citotóxicos pre-iPSC específicos del vhB específicos en comparación con los ratones tratados con células de control, lo que demuestra claramente que las células T positivas iPSC específicas del antígeno viral tienen la capacidad de reducir la replicación del VHB en un modelo murino.
Ahora debe tener una buena comprensión de cómo generar células T específicas del antígeno viral a partir de iPSC para la inmunoterapia adoptiva.
