Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen bei der Adoptivzellübertragung von iPSC-abgeleiteten viralen Antigen-spezifischen T-Zellen zur effektiven Unterdrückung der HBV-Replikation bei Mäusen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die iPSC-abgeleiteten viralen Antigen-spezifischen T-Zellen einen einzelnen Typ T-Zellrezeptor und naiven Phänotyp haben. Zur Differenzierung von HBV-spezifischen iPSC-CD8-positiven T-Zellen, Platte s183 T-Zellrezeptor-Gen-transduzierte iPSCs auf einer OP9-DL1/DL4-Monoschicht in alpha-minimum Medium, ergänzt mit 20%fetalem Rinderserum und murinem Flt3-Ligenden für ihre Kokultur in einem Zellkultur-Inkubator.
Überwachen Sie die Kokultur regelmäßig, um die Zellmorphologie zu bewerten. Entfernen Sie am 28. Tag die überstandenen und schwimmenden Zellen und lösen Sie die anhaftenden Zellen mit 0,25% Trypsin. Wenn die Zellen aus dem Kulturbehälterboden gehoben haben, stoppen Sie die enzymatische Reaktion mit acht Millilitern iPSC-Medium und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Das Pellet in 10 Milliliter frischem Medium wieder aufhängen. Verdünnen Sie die Zellen zu einer von einem iPSC abgeleiteten CD8-positiven T-Zelle auf vier s183 Peptid-gepulste Splenozyten-Verhältnisse für eine 40-stündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. In den letzten sieben Stunden vier Mikroliter verdünntes Brefeldin A in die Kultur geben, um die Transportprozesse während der Zellaktivierung zu blockieren.
Stain die Zellen für die Durchfluss zytometrische Analyse der intrazellulären Zytokine von Interesse nach Standardprotokollen. Zur hydrodynamischen HBV-Plasmidabgabe durch die Schwanzvene 10 Mikrogramm HBV-Plasmid in einem 8%-Äquivalent der Körpermasse von PBS verdünnen. Laden Sie das Plasmid in eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Spur-Nadel mit 1/2 Zoll pro Maus ausgestattet ist.
HHD-Mäuse unter einer Wärmelampe für fünf Minuten erhitzen, um die Schwanzvenen zu verdünnen, und ziehen Sie vorsichtig eine Maus in einen Kunststoff-Restrainer. Suchen Sie eine erweiterte seitliche Schwanzvene im mittleren Drittel des Schwanzes, und setzen Sie die Nadel parallel zur Vene ein, um das gesamte Volumen des Plasmids über einen Zeitraum von drei bis fünf Sekunden durch die Schwanzvene zu liefern. Für virale antigenspezifische iPSC-abgeleitete CD8-positive T-Zell-Adoptivzellübertragung, sammeln Sie die iPSC CD8-positiven T-Zellen am Tag 22 der Kultur, wie gezeigt, und säen Sie die Zellen auf eine neue 10-Zentimeter-Zellkulturschale.
Filtern Sie die schwimmenden Zellen nach 30 Minuten im Zellkultur-Inkubator durch ein 70-Mikrometer-Nylonsieb und zählen Sie die lebensfähigen Zellen. Verdünnen Sie die Zellen auf 1,5 mal 10 bis zu den sieben Zellen pro Milliliter PBS-Konzentration. Injizieren Sie 200 Mikroliter Zellen in einzelne vier bis sechs Wochen alte HHD-Mäuse, in die Schwanzvene, wie gerade gezeigt.
Führen Sie am 14. Tag nach der Zellübertragung eine hydrodynamische HBV-Plasmidabgabe durch, wie gezeigt. An den entsprechenden experimentellen Endpunkten nach der Infektion ernten Sie die Leber von jedem infizierten Tier und schneiden Sie die Leber in 0,5-mal-0,5-mal-0,3-Zentimeter-Gewebeproben. Die Proben vier bis 24 Stunden in 10% neutralen Puffer formalin legen, gefolgt von einer Entkalkung in 2,5-molarer Ameisensäure für sechs bis 24 Stunden.
Anschließend spülen Sie die Proben drei Minuten lang in Xylol, gefolgt von zwei zweiminütigen Spülungen in 100 %Ethanol, 95 % Ethanol und entionisiertem Wasser. Nach der letzten Wasserwäsche entkalken Sie das Gewebe in einem Millimolaren EDTA bei 90 Grad Celsius, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Wenn das Gewebe abgekühlt ist, spülen Sie die Proben vier Minuten lang in PBS ab und verwenden Sie Xylol und Ethanol, um die Proben zu deparaffinisieren und zu rehydrieren.
Bei der immunfluoreszenzenten Etikettierung die Abschnitte mit 200 Mikrolitern HBV-Oberflächenantigen-spezifischem Antikörper zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einer 75 bis 100%befeuchteten Kammer färben. Am Ende der Inkubation die Proben mit fünf fünfminütigen Wärten in frischem PBS für jede Wäsche waschen. Beschriften Sie die Zellen mit DAPI nach Standardprotokollen, bevor Sie die Dias mit Abdeckungen für die Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie montieren.
Für die immunhistochemische Analyse färben Sie die Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardprotokollen und bewerten Sie die Infiltration von Entzündungszellen in die Leber durch Lichtmikroskopie. Die zytometrische Analyse der iPSC-abgeleiteten CD3-positiven CD8-positiven Population zeigt, dass die HBV-T-Zellrezeptortransduktion die Erzeugung viraler s183-spezifischer CD8-positiver T-Zellen dramatisch erhöht. Nach der Stimulation mit T-depleted Splenocytes gepulst mit s183 Peptid, CD4-negative CD8 single-positive iPSC-abgeleitete T-Zellen produzieren große Mengen an Interferon-Gamma, wie durch intrazelluläre Durchfluss zytometrische Analyse und ELISA nachgewiesen.
Nach einer HBV-Infektion durch hydrodynamische Injektion erreicht die DNA-Replikation am sechsten Tag ihren Höhepunkt und reduziert sich schrittweise, wie die Echtzeit-PCR-Analyse beobachtet. Darüber hinaus ist die Virusreplikation bei Mäusen, die HBV-virale antigen-spezifische T-Zellen erhalten, zu allen Zeitpunkten signifikant reduziert, verglichen mit Mäusen, die Kontrollzellen erhalten. HBV-Oberflächenprotein ist auch bei Mäusen, die HBV-virale Antigen-spezifische pre-iPSC-Zytotoxische Lymphozyten erhalten, im Vergleich zu Mäusen, die mit Kontrollzellen behandelt wurden, erheblich reduziert, was deutlich zeigt, dass virale antigenspezifische iPSC-cd8-positive T-Zellen die Fähigkeit haben, die HBV-Replikation in einem murinen Modell zu reduzieren.
Sie sollten jetzt ein gutes Verständnis dafür haben, wie virale antigenspezifische T-Zellen aus iPSC für die Adoptivimmuntherapie erzeugt werden können.
