Bu yöntem farelerde HBV replikasyonunun etkin bastırılması için iPSC kaynaklı viral antijen spesifik T hücresinin benimseyen hücre transferinde anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, iPSC kaynaklı viral antijene özgü T hücrelerinin tek tip T hücre reseptörüne ve naif fenotiplere sahip olmasıdır. HBV'ye özgü iPSC CD8-pozitif T hücrelerinin farklılaşması için, plaka s183 T hücre reseptör gen-transdükre edilmiş iPSC'ler op9-DL1/DL4 monolayer alfa-minimum ortamda 20% fetal sığır serum ve murine Flt3 ligand ile desteklenen bir hücre kültürü inkübatör kendi co-kültür için.
Hücre morfolojisini değerlendirmek için ortak kültürü düzenli olarak izleyin. 28. günde, süpernatant ve yüzen hücreleri çıkarın ve %0,25 tripsin ile yapışık hücreleri ayırın. Hücreler kültür kabı nın altından kalktığında, sekiz mililitre iPSC orta sıyla enzimatik reaksiyonu durdurun ve hücreleri santrifüj le toplayın.
Taze orta 10 mililitre pelet resuspend. Hücreleri bir iPSC kaynaklı CD8-pozitif T hücresine seyreltin ve hücre kültürü kuluçka makinesinde 40 saatlik bir kuluçka için dört s183 peptid-darbeli splenosit oranına ayarlayın. Son yedi saat içinde, hücre aktivasyonu sırasında taşıma süreçlerini engellemek için kültüre seyreltilmiş brefeldin A dört mikrolitre ekleyin.
Standart protokollere göre ilgi hücre içi sitokinlerin akış sitometrik analizi için hücreleri lekeleyin. Kuyruk damarı ile hidrodinamik HBV plazmid iletimi için, PBS vücut kütlesinin% 8 eşdeğer HBV plazmid 10 mikrogram seyreltin. Plazmidi fare başına 26-gauge, 1/2-inç iğne ile donatılmış bir üç mililitrelik şırınga yükleyin.
Kuyruk damarlarını genişletmek için BEŞ dakika boyunca bir ısı lambası altında Isı HHD fareler, ve dikkatle plastik bir restrainer içine bir fare çekin. Kuyruğun orta üçte bir dilate lateral kuyruk damarı bulmak ve üç-beş saniyelik bir süre boyunca kuyruk ven ile plazmid tüm hacmi teslim etmek için ven paralel iğne ekleyin. Viral antijene özgü iPSC kaynaklı CD8-pozitif T hücre benimseyen hücre transferi için, gösterildiği gibi kültürün 22.
Hücre kültürü kuluçka makinesinde 30 dakika kaldıktan sonra yüzen hücreleri 70 mikrometrelik bir naylon süzgeçten filtreleyin ve canlı hücreleri sayın. PBS konsantrasyonu mililitre başına yedi hücre için 1,5 kez 10 hücreleri seyreltin. Dört ila altı haftalık HHD farelerine 200 mikrolitre hücre enjekte edin, az önce gösterildiği gibi kuyruk damarına.
Hücre transferinden sonra 14. Enfeksiyon sonrası uygun deneysel uç noktalarda, her enfekte hayvandan karaciğeri hasat edin ve karaciğerleri 0,5 by-0,5 by-0,3 santimetrelik doku örnekleri ne kadar kesin. Örnekleri 4-24 saat boyunca %10 nötr tampon formaline yerleştirin, ardından 2,5 molar formik asitte altı ila 24 saat kireçlenme yi takip edin.
Daha sonra, örnekleri üç dakika boyunca ksilen içinde durulayın, ardından %100 etanol, %95 etanol ve deiyonize suyla iki dakikalık durulama. Son su yıkamadan sonra, 90 santigrat derece bir milimolar EDTA dokuları dekalsite, oda sıcaklığında 30 dakikalık kuluçka izledi. Doku soğuduğunda, pbs'deki örnekleri dört dakika durulayın ve numuneleri ayırmak ve yeniden sulandırmak için ksilen ve etanol kullanın.
İmmünofloresan etiketleme için, 75 ila %100 nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında iki saat boyunca 200 mikrolitre HBV yüzey antijene özgü antikor ile kesitleri lekelayın. Kuluçka süresinin sonunda, numuneleri her yıkama için taze PBS'de beş adet beş dakikalık yıkayarak yıkayın. Floresan mikroskopi ile görüntüleme için slaytları kapaklı dudaklarla takmadan önce hücreleri standart protokollere göre DAPI ile etiketleyin.
İmmünohistokimyasal analiz için, standart protokollere göre hematoksilin ve eozin ile kesitleri lekeleyin ve ışık mikroskobu ile inflamatuar hücrelerin karaciğere infiltrasyonunu değerlendirin. iPSC türetilmiş CD3-pozitif CD8-pozitif popülasyonun akış sitometrik analizi, HBV T hücre reseptör transdüksiyonunun viral s183-spesifik CD8-pozitif T hücrelerinin oluşumunu önemli ölçüde artırdığını ortaya koymaktadır. S183 peptid ile darbeli T-tükenmiş splenositler ile uyarılmasından sonra, CD4-negatif CD8 tek pozitif iPSC türetilmiş T hücreleri hücre içi akış sitometrik analizi ve ELISA tarafından tespit edilen büyük miktarda interferon gama üretirler.
Hidrodinamik enjeksiyon ile HBV enfeksiyonu sonra, DNA replikasyonu gün altı zirveleri ve yavaş yavaş azalır, gerçek zamanlı PCR analizi ile gözlenen. Ayrıca, viral replikasyon önemli ölçüde kontrol hücreleri alan farelere göre HBV viral antijenik spesifik T hücreleri alan farelerde her zaman noktalarında azalır. HBV yüzey proteini de önemli ölçüde kontrol hücreleri ile tedavi farelere göre HBV viral antijen-spesifik pre-iPSC sitotoksik lenfositler alan farelerde azalır, açıkça viral antijene özgü iPSC CD8-pozitif T hücrelerinin bir murine modelinde HBV replikasyonazaltmak için yeteneğine sahip olduğunu gösteren.
Şimdi nasıl benimseyen immünoterapi için iPSC viral antijen-spesifik T hücreleri oluşturmak için iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.
