이 방법은 마우스에서 HBV 복제의 효과적인 억제를 위해 iPSC 유래 바이러스 항원 특이적 T 세포의 입양 세포 전달에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 iPSC 유래 바이러스 항원 특이적 T 세포가 단일 유형 T 세포 수용체 및 순진한 표현형을 갖는다는 것입니다. HBV 특이적 iPSC CD8 양성 T 세포의 분화를 위해, 플레이트 s183 T 세포 수용체 유전자-변환 된 iPSCs에 OP9-DL1/DL4 단층에서 알파 최소 배지에서 20%의 태아 소 혈청 및 뮤린 Flt3 리간드로 보충하여 쿠베이포어의 세포 배양에 대한 공동 배양에 대한 보충.
세포 형태를 평가하기 위해 정기적으로 공동 배양을 모니터링합니다. 28일째에, 상피 및 부동 세포를 제거하고, 0.25%의 트립신으로 부착세포를 분리한다. 세포가 배양 용기 바닥에서 들어 올릴 때, iPSC 배지의 8밀리리터로 효소 반응을 멈추고 원심분리에 의해 세포를 수집한다.
신선한 매체의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 세포 배양배기에서 40시간 배양에 대해 4개의 s183 펩타이드 펄스 비백세포 비율로 하나의 iPSC 유래 CD8 양성 T 세포로 세포를 희석시켰다. 마지막 7시간 동안, 세포 활성화 중 운송 공정을 차단하기 위해 희석 된 brefeldin A의 4 마이크로 리터를 배양에 추가합니다.
표준 프로토콜에 따라 관심있는 세포 내 사이토카인의 흐름 세포 측정 분석을 위한 세포를 얼룩지게 합니다. 테일 정맥을 통해 유체 역학 HBV 플라스미드 전달을 위해 PBS의 체질량의 8%에 해당하는 10마이크로그램의 HBV 플라스미드를 희석시킵니다. 플라스미드를 마우스 당 26 게이지, 1/2인치 바늘이 장착된 3밀리리터 주사기 1개에 적재합니다.
HHD 마우스를 열램프 아래에서 5분간 가열하여 꼬리 정맥을 넓히고 마우스를 조심스럽게 플라스틱 제지제에 넣습니다. 꼬리의 중간 3분의 1에 팽창된 측면 꼬리 정맥을 찾아서, 3~5초 동안 꼬리 정맥을 통해 플라스미드의 전체 부피를 전달하기 위해 정맥에 평행하게 바늘을 삽입한다. 바이러스 항원 특이적 iPSC-유래 CD8 양성 T 세포 입양 세포 전달의 경우, 입증된 바와 같이 22일째에 iPSC CD8 양성 T 세포를 수집하고 세포를 새로운 10센티미터 세포 배양 접시에 시드한다.
세포 배양 인큐베이터에서 30분 후, 70마이크로미터 나일론 스트레이너를 통해 부동 세포를 걸러내고 실행 가능한 세포를 계산한다. PBS 농도의 밀리리터 당 7개의 세포에 1.5배 10배까지 세포를 희석시. 개별 4-6 주 된 HHD 마우스에 세포의 200 마이크로 리터를 주입, 꼬리 정맥에 그냥 입증.
세포 전달 후 14일째에, 입증된 바와 같이 유체역학적 HBV 플라스미드 전달을 수행한다. 적절한 실험적 종점에서 감염 후 각 감염된 동물로부터 간을 수확하고 간을 0.5-0.5-0.3센티미터 조직 샘플로 자릅니다. 샘플을 4~24시간 동안 10% 중성 완충파 포르말린에 넣고 6~24시간 동안 2.5-대구산에 탈화한다.
다음으로, 3분 동안 자일렌으로 샘플을 헹구고, 100%에탄올, 95%에탄올, 탈이온화된 물로 2분 간 헹구는 것입니다. 마지막 물 세척 후, 90섭씨에서 1밀리알라드 EDTA로 조직을 탈칼시피한 다음 실온에서 30분 동안 배양합니다. 조직이 냉각되면 PBS에서 샘플을 4 분 동안 헹구고 자일렌과 에탄올을 사용하여 샘플을 분리하고 재수화하십시오.
면역형광 라벨링을 위해, 75~100% 가습된 챔버에서 실온에서 2시간 동안 HBV 표면 항원 특이적 항체200 마이크로리터로 섹션을 얼룩지게 한다. 인큐베이션이 끝나면 매 세척시 신선한 PBS로 5분간 세척하여 샘플을 세척합니다. 형광 현미경 검사법에 의한 이미징을 위한 커버립으로 슬라이드를 장착하기 전에 표준 프로토콜에 따라 DAPI로 세포를 라벨로 지정합니다.
면역조직화학적 분석을 위해, 표준 프로토콜에 따라 헤마톡시린과 에오신으로 단면을 얼룩지게 하고, 광 현미경검사법에 의해 간으로 염증세포의 침투를 평가한다. iPSC 유래 CD3 양성 CD8 양성 집단의 유동 세포 측정 분석은 HBV T 세포 수용체 전체 전체 전도가 바이러스 s183 특이적 CD8 양성 T 세포의 생성을 극적으로 증가시킨다는 것을 보여준다. s183 펩타이드로 펄스된 T 고갈된 고갈된 고갈된 비백세포를 자극한 후, CD4-음수 CD8 단일 양성 iPSC 유래 T 세포는 세포내 유동 세포 분석 및 ELISA에 의해 검출된 바와 같이 다량의 인터페론 감마를 생성한다.
유체 역학 주입에 의한 HBV 감염 후, DNA 복제는 6일째에 정점에 달하고 실시간 PCR 분석에 의해 관찰된 바와 같이 점차적으로 감소합니다. 또한, 바이러스 복제는 대조군 세포를 수신하는 마우스에 비해 HBV 바이러스 성 항원 특이적 T 세포를 수신하는 마우스의 모든 시점에서 현저히 감소된다. HBV 표면 단백질은 또한 HBV 바이러스 항원 특이적 전iPSC 세포독성 림프구를 조절 세포로 치료한 마우스에 비해 실질적으로 감소하며, 바이러스 항원 특이적 iPSC CD8 양성 T 세포가 뮤린 모델에서 HBV 복제를 감소시키는 능력을 가지고 있음을 분명히 입증한다.
이제 입양 면역 요법을 위해 iPSC에서 바이러스 성 항원 특이적 T 세포를 생성하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.
