שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהעברת תאים מאמצים של תא T אנטיגן ויראלי נגזר iPSC לדיכוי יעיל של שכפול HBV בעכברים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי iPSC נגזר אנטיגן ספציפי לתאי T יש קולטן תא T סוג אחד פנוטיפ נאיבי. עבור בידול של תאי T חיוביים iPSC CD8 ספציפיים ל- HBV, לוח s183 T קולטן תאים גנים-מומרים iPSCs על מונוליאר OP9-DL1/DL4 במדיום אלפא-מינימום בתוספת 20% סרום חזיר עוברי וליגנד Flt3 מורין לתרבות השותפה שלהם באינקובטור תרבות התא.
לפקח על שיתוף התרבות באופן קבוע כדי להעריך את מורפולוגיה התא. ביום 28, הסר את התאים העל-טבעיים והצופים וניתוק התאים החסידיים באמצעות 0.25%trypsin. כאשר התאים התרוממים מתחתית מיכל התרבות, עצרו את התגובה האנזימטית עם שמונה מיליליטר של מדיום iPSC, ואספו את התאים על ידי צנטריפוגה.
תן את הכדור ב-10 מיליליטר של מדיום טרי. לדלל את התאים לתא T אחד iPSC נגזר CD8 חיובי לארבעה יחס טחול פפטיד פעום s183 עבור דגירה של 40 שעות באינקובטור תרבות התא. במהלך שבע השעות האחרונות, להוסיף ארבעה microliters של brefeldin מדולל A לתרבות, כדי לחסום את תהליכי התחבורה במהלך הפעלת התא.
להכתים את התאים לניתוח ציטומטרי זרימה של ציטוקינות תאיים של עניין על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. עבור משלוח פלסמיד הידרודינמי HBV דרך וריד הזנב, לדלל 10 מיקרוגרם של HBV פלסמיד ב 8% שווה ערך של מסת הגוף של PBS. טען את הפלסמיד למזרק אחד של שלושה מיליליטר המצויד במחט בגודל 26 מד ו-1/2 אינץ' לכל עכבר.
מחממים עכברי HHD מתחת למנורת חום במשך חמש דקות כדי לרחף את וריד הזנב, ולמשוך בזהירות עכבר לתוך מרסן פלסטיק. אתר וריד זנב צד מורחב בשליש האמצעי של הזנב, והכנס את המחט המקבילה לווריד כדי לספק את כל נפח הפלסמיד דרך וריד הזנב על פני תקופה של שלוש עד חמש שניות. עבור העברת תאים מאמצים תאי T חיוביים IPSC ספציפיים לאנטיגן, לאסוף את תאי ה- T החיוביים iPSC CD8 ביום 22 של התרבות כפי שהוכח, ולזרע את התאים על צלחת חדשה של 10 ס"מ של תאים.
לאחר 30 דקות בחממה לתרבות התאים, סנן את התאים הצפים באמצעות מסננת ניילון 70 מיקרומטר, וספיר את התאים בני קיימא. לדלל את התאים ל 1.5 פעמים 10 לשבעה תאים למיליליטר של ריכוז PBS. הזרק 200 מיקרוליטרים של תאים לעכברי HHD בודדים בני ארבעה עד שישה שבועות, לווריד הזנב כפי שהוכח זה בלבד.
ביום 14 לאחר העברת תא, לבצע משלוח פלסמיד HBV הידרודינמי כפי שהוכח. בנקודות הקצה הניסיוניות המתאימות לאחר ההדבקה, לקצור את הכבד מכל חיה נגועה, וחותכים את הכבדים לדגימות רקמה של 0.5 על 0.5 על 0.3 ס"מ. הנח את הדגימות לפורמלין חיץ ניטרלי של 10% למשך ארבע עד 24 שעות, ואחריו מדבקה בחומצה פורמית טוחה 2.5 במשך שש עד 24 שעות.
לאחר מכן, לשטוף את הדגימות קסילן במשך שלוש דקות, ואחריו שתי שטיפות שתי דקות ב 100% אתנול, 95% אתנול, ומים deionized. לאחר שטיפת המים האחרונה, מדקים את הרקמות ב- EDTA של מילימולר אחד בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. כאשר הרקמה התקררה, שטפו את הדגימות ב- PBS במשך ארבע דקות, ולהשתמש קסילן ואתנול כדי deparaffinize ולייבש מחדש את הדגימות.
לתיוג immunofluorescent, להכתים את החלקים עם 200 microliters של נוגדן אנטיגן משטח HBV במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתא 75 כדי 100% לחות. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם חמש חמש דקות שטיפות PBS טריים עבור כל לשטוף. סמן את התאים ב- DAPI בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים לפני טעינת השקופיות עם כיסויים להדמיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
עבור ניתוח אימונוהיסטוכימי, להכתים את החלקים עם hematoxylin ו eosin על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, ולהעריך את החדירה של תאים דלקתיים לתוך הכבד על ידי מיקרוסקופיה אור. ניתוח ציטומטרי זרימה של האוכלוסייה CD8 חיובית CD8 חיובית iPSC מגלה כי התברות קולטן תא HBV T מגדיל באופן דרמטי את הדור של תאי T נגיפיים s183 ספציפיים CD8 חיובי. לאחר גירוי עם T-דל שומן טחול פעמו עם פפטיד s183, CD4 שלילי CD8 יחיד חיובי iPSC נגזר תאי T לייצר כמויות גדולות של גמא אינטרפרון, כפי שזוהה על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה תאית ELISA.
לאחר זיהום HBV על ידי הזרקה הידרודינמית, שכפול ה- DNA מגיע לשיאו ביום השישי ומצטמצם בהדרגה, כפי שנצפה על ידי ניתוח PCR בזמן אמת. יתר על כן, שכפול ויראלי מצטמצם באופן משמעותי בכל נקודות הזמן בעכברים המקבלים תאי T אנטיגניים ספציפיים ל- HBV בהשוואה לעכברים המקבלים תאי בקרה. חלבון פני השטח HBV הוא גם ירד באופן משמעותי בעכברים המקבלים HBV ויראלי אנטיגן ספציפי לימפוציטים טרום iPSC cytotoxic בהשוואה לעכברים שטופלו בתאי בקרה, הוכחת בבירור כי אנטיגן ספציפי iPSC CD8 חיובי תאי T יש את היכולת להפחית שכפול HBV במודל מורין.
עכשיו אתה צריך הבנה טובה של איך ליצור תאי T אנטיגן ספציפיים ויראלי מ iPSC עבור אימונותרפיה מאמצת.
