I cambiamenti metabolici nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici consentono loro di passare dal loro stato quiescente a uno stato di differenziazione per sostenere le richieste di formazione del sangue. L'alterazione della plasticità metabolica delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici porta a disturbi ematologici. Il nostro protocollo aiuterà a misurare la regolazione metabolica e la salute delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici durante lo sviluppo del sangue e le malattie.
L'analisi della respirazione mitocondriale e della glicolisi delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici è difficile in quanto sono popolazione fragile e rara. Il nostro protocollo ottimizzato consente l'isolamento di una maggiore quantità di cellule staminali ematopoietiche e progenitrici dal midollo osseo murino, migliora la loro vitalità durante l'incubazione, facilita l'analisi del flusso extracellulare di HSPC non aderenti e fornisce parametri di iniezione ottimizzati per il farmaco che mira alla fosforilazione ossidativa e alle vie glicolitiche. Per iniziare questa procedura, riempire i pozzi della piastra di utilità e le camere intorno ai pozzi con acqua sterile.
Immergere la cartuccia del sensore nella piastra di utilità assicurandosi che i sensori siano completamente coperti dall'acqua. Quindi posizionare la cartuccia immersa nella piastra di utilità in un incubatore non di CO2 a 37 gradi Celsius per incubare durante la notte. In un armadio di biosicurezza di classe II, aggiungere 40 microlitri di soluzione 0,1%PLL disponibile in commercio a ciascun pozzo della piastra di dosaggio.
Coprire la piastra di dosaggio con il coperchio fornito nel kit e incubare la piastra chiusa a temperatura ambiente sotto il cofano per un'ora. Successivamente, utilizzare un aspiratore sterile a base di vuoto per rimuovere la soluzione in eccesso e asciugare ad aria la piastra sotto il cofano. Per raccogliere cellule di midollo osseo murino mononucleate, aggiungere cinque millilitri di gradiente di densità medio a un tubo conico da 15 millilitri.
Aggiungere lentamente cinque millilitri della sospensione cellulare del midollo osseo assicurandosi che le cellule rimangano come uno strato al di sopra del mezzo gradiente di densità. Centrifugare a 500 volte g e a temperatura ambiente per 30 minuti assicurandosi che la centrifuga sia alla più bassa accelerazione possibile. Raccogliere l'interfaccia centrale delle cellule mononucleate in un tubo fresco da 15 millilitri.
Quindi lavare le celle con cinque millilitri di 1X PBS contenenti 2%FBS. Centrifuga a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare le celle in 300 microlitri di 1X PBS contenenti 2%FBS.
Successivamente, aliquote 10 microlitri della sospensione cellulare per il controllo non macchiato o monocolore in un tubo FACS. Per raccogliere HSPC LSK da cellule del midollo osseo murino mononucleate, aggiungere 15 microlitri di cocktail anticorpale di biotina a 300 microlitri di cellule mononucleate del midollo osseo. Per raccogliere HSPC LSK da cellule del midollo osseo murino mononucleate, aggiungere 15 microlitri di cocktail anticorpale di biotina a 300 microlitri di cellule mononucleate del midollo osseo.
Posizionare i tubi in un secchio di ghiaccio posizionato su uno shaker in frigorifero per incubare a quattro gradi Celsius con agitazione per 30 minuti. Quindi aggiungere 10 millilitri di PBS 1X prerimente refrigerato contenente 2%FBS alle celle. Centrifuga a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 400 microlitri di 1X PBS contenenti 2%FBS. Vortice brevemente le microperline anti-biotina prima dell'uso. Aggiungere 80 microlitri delle microperline a ciascun campione e mescolare bene.
Incubare per altri 20 minuti a quattro gradi Celsius con agitazione. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di PBS pre-refrigerato contenenti 2%FBS alle celle. Centrifugare il tubo a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un millilitro di PBS contenente il 2%FBS. Conservare la sospensione cellulare a quattro gradi Celsius durante la configurazione dell'unità di separazione magnetica. Posizionare la colonna in un campo magnetico per il separatore di smistamento delle celle assistite magnetiche a quattro gradi Celsius.
Preparare la colonna per la separazione magnetica risciacquarla con tre millilitri di 1X PBS contenenti 2%FBS sotto flusso di gravità a quattro gradi Celsius. Aggiungere la sospensione cellulare alla colonna pre-bagnata a quattro gradi Celsius. Lasciare passare tutte le cellule attraverso la colonna a quattro gradi Celsius e raccogliere l'effluente in un tubo conico da 15 millilitri.
Quindi, lavare la colonna con tre millilitri di 1X PBS e 2%FBS a quattro gradi Celsius. Ripetere questo lavaggio tre volte. Raccogli il flusso e mantienilo a quattro gradi Celsius.
Centrifugare il tubo conico contenente il flusso a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le celle in 0,5 millilitri di 1X PBS con 2%FBS e trasferire la sospensione su un tubo FACS. Quindi aggiungere 24 microlitri del cocktail anticorpale LSK a ogni 10 milioni di cellule.
Coprire il tubo con un foglio e incubare al buio a quattro gradi Celsius con agitazione per un'ora. Successivamente, aggiungere tre millilitri di 1X PBS con 2%FBS al tubo FACS. Centrifuga a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare le cellule etichettate con anticorpi in un millilitro di 1X PBS contenente 2%FBS. Poco prima dello smistamento, aggiungere un microlitro di un milligrammo per millilitro propidio ioduro alla sospensione cellulare e utilizzare un colino da 40 micrometri per filtrare il contenuto del tubo FACS. In primo luogo, centrifugare le cellule LSK raccolte a 500 volte g e a temperatura ambiente per cinque minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in mezzi completi ad una concentrazione finale di almeno 70.000 cellule per 40 microlitri. Semina 40 microlitri di questa sospensione cellulare nei pozzi di una piastra a otto pozzatti rivestita in PLL assicurandosi di lasciare tutti i pozzi d'angolo vuoti. Centrifugare la piastra a 450 volte g e a temperatura ambiente per un minuto.
Utilizzare un microscopio invertito per assicurarsi che le cellule siano attaccate alla parte inferiore dei pozzi. Successivamente, aggiungere 135 microlitri di supporto completo alle cellule in ogni pozzo portando il volume finale di ogni pozzo a 175 microlitri. Aggiungere 175 microlitri di supporti completi ai due angoli della piastra come spazi vuoti.
Incubare le cellule in un incubatore non di CO2 a 37 gradi Celsius per due ore. Quindi impostare un programma per l'analizzatore per aggiungere farmaci a ogni pozzo della piastra come descritto nella tabella due e nella tabella tre del protocollo di testo. Per la prova di stress mitocondriale, recuperare la cartuccia del sensore nella piastra di utilità dall'incubatore in modo tale che ogni pozzo abbia una concentrazione finale di due oligomicina micromolare, 1,5 micromolare FCCP e 0,5 micromolare di rotenone e antimicina A, se necessario.
Rimuovere il coperchio dalla cartuccia del sensore e posizionarlo sul vassoio dello strumento. Iniziare il processo di calibrazione che richiederà 20 minuti. Al termine della calibrazione, rimuovere la piastra di utilità e sostituirla con la piastra di dosaggio contenente le celle LSK.
Premere continua per avviare il programma impostato in precedenza. Al termine del programma, recuperare i dati e analizzarli. In questo studio, una quantità massima di HSPC LSK murini vitali sono isolati e la loro glicolisi e metabolismo mitocondriale viene misurata con un analizzatore di flusso extracellulare.
Sebbene l'analisi del flusso extracellulare sia tradizionalmente utilizzata per le cellule aderenti, questo metodo rende gli HSPC LSK aderenti ai pozzi rivestiti in PLL che consentono la misurazione del flusso extracellulare e quindi la salute metabolica degli HSPC LSK. Al fine di misurare la respirazione mitocondriale attraverso il tasso di consumo di ossigeno e la glicolisi attraverso il tasso di acidificazione extracellulare in condizioni basali e di stress, i farmaci che interferiscono con la glicolisi e la respirazione mitocondriale vengono iniettati in sequenza. Come previsto, il livello basale del tasso di acidificazione extracellulare è più elevato per gli HSPC LSK coltivati in glucosio e piruvati positivi rispetto a quelli coltivati in mezzi negativi.
L'iniezione con glucosio non ha cambiato il tasso di acidificazione extracellulare per le cellule coltivate nei mezzi positivi, ma ha aumentato la glicolisi delle cellule in mezzi negativi. Tuttavia, il livello basale di queste cellule è rimasto ancora più basso nel gruppo positivo. L'iniezione con oligomicina ha attivato la glicolisi al suo livello massimo nel gruppo positivo, ma non ha influenzato il gruppo negativo.
L'iniezione con l'analogo glucosio a 2-DG ha restituito il tasso di acidificazione extracellulare a livelli non glicolitici. Per la prova di stress mitocondriale, l'iniezione di oligomicina iperpolarizzò la membrana mitocondriale impedendo un maggiore pompaggio di protoni attraverso i complessi ETC e riducendo così il tasso di respirazione mitocondriale. L'iniezione di FCCP spinge il tasso di consumo di ossigeno al massimo mentre le cellule cercano di recuperare il potenziale della membrana mitocondriale.
L'iniezione con altri due inibitori della catena di trasporto degli elettroni fa sì che la respirazione mitocondriale si fermi completamente e quindi il tasso di consumo di ossigeno sia tornato al suo livello minimo. Si prega di evitare l'uso di tampone di lisi dei globuli rossi per l'isolamento delle cellule mononucleari. Si consiglia la separazione del gradiente Ficoll per prevenire la formazione di ciuffi e ridurre la perdita di LSK.
Utilizzando il nostro metodo ottimizzato, possiamo misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche rare e fragili e lo studio di segnali metabolici regolano l'ematopoiesi normale e maligna.
