يتم التعامل مع التزجيج عادة من خلال سمية العوامل الخفية. وإعادة إدراجها في عينات صغيرة يمكن تبريدها بسرعة. هذا البروتوكول يتيح vitrification من كميات كبيرة من الخلايا أثناء استخدام تركيز منخفض CPA أثناء الحضانة قبل.
باستخدام الجفاف التناضحي السريع ، يتركز CPA المنخفض بين القبو في جهاز السوائل مباشرة قبل التزجيج. وهذا يلغي الحاجة إلى توازن كامل تركيزات CPA السامة. قد توفر عملية تزجيج القطرات السائبة خلايا كبدية قابلة للحياة ونشطة أيضًا لاستخدام زراعة الكبد وأجهزة الكبد الاصطناعية الحيوية التي تعوقها حاليًا النتائج غير الكافية بعد الحفظ بالتبريد.
قد يمكن تكييف هذه الطريقة لضخاة أنواع الخلايا الأخرى التي تحتاج إلى الحفاظ على التبريد بكميات كبيرة؛ مثل منتجات الدم أو الخلايا الجذعية وغيرها. لتبدأ، وجعل vitrification الحل 1 عن طريق إضافة 40 ملليغرام من BSA إلى 17.0 ملليلتر من جامعة ويسكونسن الحل. استخدم فلتر ميكرومتر 0.22 لتصفية المحلل معقمة وتخزينه عند أربع درجات مئوية.
جعل vitrification الحل 2 كما هو موضح في البروتوكول. وتصفية معقمة من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. تحميل 3.5 ملليلتر من محلول V2 معقم مصفى في حقنة ثلاثة ملليلتر وتخزينها عند أربع درجات مئوية.
لإعداد جهاز التزجيج القطرة السائبة، أولا، قطع على طول جانب واحد من خلط الإبر الأكمام الرمادية الخارجية. ثني الأكمام مفتوحة لإزالته من إبرة الخلط. ثم، قطع إبرة الخلط إلى طول 20 ملليمترا وإدراج مأخذ قطع في إبرة حقن قياس 20.
الشريحة اثنين من 25 ملليمتر أنابيب السيليكون أقسام على مداخل إبرة الخلط. وتأمين موقفهم مع الغراء. تعقيم هذا التجميع عن طريق autoclaving.
املأ قارورة ديوار العقيمة بالنيتروجين السائل. وتعقيم الخارج مع ايزوبروبانول قبل وضعه في معقمة لامينر تدفق الخلية هود الثقافة. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة حيث يمكن للنيتروجين السائل أن يسبب حروقًا خطيرة.
لإنشاء جهاز جمع قطرات إدراج قمع مع نفس القطر الخارجي كما القطر الداخلي للديوار، في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. باستخدام ملقط كبيرة، اضغط ببطء على جهاز جمع قطرات أسفل في النيتروجين السائل في وضعها الرأسي النهائي. تأكد من أن أنبوب مخروطي تقع في وضع عمودي في الجزء السفلي من ديوار.
ومستوى النيتروجين السائل هو واحد أقل سنتيمتر من حافة القمع. لتركيب مضخة حقنة في موقف عمودي على جدار غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، وربط سلسلة من القدمين مضخة حقنة لمسامير جاحظ من خلية ثقافة هود الجدار. ثم، ضع ديوار النيتروجين السائل مع جهاز جمع قطرات تحت مضخة حقنة محمولة عموديا.
بعد الحصول على خلايا الكبد الجرذان المعزولة حديثًا ، عد تركيز المخزون عن طريق الاستبعاد الأزرق ثلاثي التحريك. ونقل 40 مليون خلايا كبدية قابلة للحياة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. الطرد المركزي hepatocytes في 50 مرة G لمدة خمس دقائق دون انقطاع.
استلهموا المُنطّع. إعادة تعليق خلايا الكبد في 3.4 ملليلتر من V1 الحل. واحتضان على الجليد لمدة ثلاث دقائق.
ثم، إضافة 150 ميكرولترات من DMSO و 150 ميكرولترات من EG؛ مزيج بلطف واحتضان على الجليد مرة أخرى لمدة ثلاث دقائق. إضافة 150 ميكرولترات من DMSO و 150 ميكرولترات من EG إلى الكبد مرة أخرى ومزيج بلطف. تحميل 3.5 ملليلتر من هذا الخليط في حقنة ثلاثة ملليلتر.
أدخل الحقنة مع خلايا الكبد المحتضنة مسبقًا والمحاقن مع V2 Solution على محول مضخة الحقنة. إرفاق اثنين من الإناث Luer قفل خرطوم بارب محولات إلى الحقن. وشريحة أنابيب السيليكون من الجمعية إبرة خلط على تركيبات بارب.
ضع هذا التجميع بأكمله في مضخة الحقنة. بعد ثلاث دقائق من الطبعة الأخيرة من DMSO و EG إلى خلايا الكبد، بدء المضخة في ملليلتر اثنين في الدقيقة الواحدة. بعد أن تم إضافة جميع خلايا الكبد إلى النيتروجين السائل وقف المضخة.
باستخدام إبرة قياس 20، ثقب 10 ثقوب صغيرة في غطاء أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. ولف خارج الغطاء مع فيلم مرن، وخلق صمام من شأنها أن تمكن من الهروب من التبخر النيتروجين السائل المتبقية. لجمع قطرات الكبد vitrified، أولا إزالة القمع من ديوار مع النيتروجين السائل.
المقبل، مع ملقط طويلة، إخراج أنبوب مخروطي الذي يحتوي على قطرات من النيتروجين السائل، وصب ببطء من النيتروجين السائل الزائد من أنبوب مخروطي. إغلاق أنبوب مخروطي مع غطاء مثقوب ومن ثم وضع مباشرة الأنبوب المخروطية مغلقة مع قطرات الكبد vitrified مرة أخرى في ديوار مع النيتروجين السائل. وأخيرا، نقل أنبوب مخروطي من النيتروجين السائل إلى كريوتانك النيتروجين السائل.
بعد إجراء حل إعادة التروّي مع السكروز و DMEM وسائل الإعلام ثقافة الكبد، استخدم مرشح ميكرومتر 0.22 لتصفية العقيمة. ثم ادفأها إلى 37 درجة مئوية. لإعادة الدفء الكبد إزالة أنبوب مخروطي مع الكبد vitrified من cryotank ونقله في ديوار النيتروجين السائل إلى غطاء محرك السيارة الفرعية.
تخفيف طفيفة الغطاء ووضع أنبوب مخروطي مرة أخرى في النيتروجين السائل. العمل بسرعة، إضافة جميع قطرات الكبد vipatocyified إلى الكوابر فارغة، ثم إضافة بسرعة 100 ملليلتر من 37 درجة مئوية حل إعادة الدفء الدافئة في حين اثارة لمدة 10 ثوان. عندما تتم إزالة قطرات من النيتروجين السائل داخل est تجميد يحدث في غضون ثوان إذا لم يتم إعادة الدفء بسرعة قطرات.
لذلك ، من المهم إضافة الوسائط التي تعيد الدفء مباشرة إلى القطرات أثناء التحريك. تقسيم محلول إعادة التروّد مع خلايا الكبد إلى أنبوبين مخروطيين 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة دقيقتين في 100 مرة G في أربع درجات مئوية دون انقطاع.
استلهموا من المُتشردين ليتركوا حجمًا إجماليًا قدره 12.5 ملليلتر باستخدام علامة تخرج الأنبوب كمرجع. لتخفيف محلول إعادة الوارة إلى 50٪ إضافة 12.5 ملليلتر من الجليد بارد DMEM لكل أنبوب مخروطي. إعادة تعليق واحتضان على الجليد لمدة ثلاث دقائق.
لتخفيف محلول إعادة الواردة إلى 25٪ إضافة 25 ملليلتر من الجليد بارد DMEM لكل أنبوب مخروطي. بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 50 مرات G في أربع درجات مئوية دون انقطاع، سبيرت فائقة وإعادة تعليق خلايا الكبد في ملليلتر اثنين من المتوسطة الثقافة المطلوب. عند قياسها باختبار الاستبعاد الأزرق ثلاثي التحريك ، والذي يحدد سلامة الغشاء ، أدى تزجيج القطرات السائبة إلى قابلية حيوية الكبدية مباشرة بعد الحفظ بنسبة 79٪ كان هذا أعلى بكثير من 68٪ قابلية البقاء بعد الحفظ المثلى للتبريد الكلاسيكي.
وكان العائد من التبزير بالجملة قطرات 56٪الذي كان 10٪ أعلى وأكثر اتساقا من الحفظ المبرد الكلاسيكية. باستخدام مقايسة استقلاب الغراء السابق في الثقافات الكلية والسندويشات على المدى الطويل ، تم قياس النشاط الأيضي في الخلايا الكبدية ليكون أعلى بكثير بعد تزجيج القطرة السائبة ثم بعد الحفظ المبرد الكلاسيكي. كان تخليق الزلال، كمعلمة الأكثر استخداماً من وظيفة الاصطناعية من خلايا الكبد، أكبر من قبل ما يقرب من ضعفين بعد التزجيج قطرات السائبة، ثم بعد الحفظ المبرد الكلاسيكية.
تم استخدام إنتاج اليوريا لقياس وظيفة إزالة السموم الكبدية في ثقافة أسبوع واحد. في القطرات السائبة الكبدية vitrified، وكان إنتاج اليوريا أعلى بكثير من ذلك في الكبدات الكبدية التبريد الكلاسيكية. للحصول على نتائج متسقة بعد التبزيم القطرة السائبة من المهم أن تتبع التوقيت بالضبط أثناء الحضانة المسبقة من CPAs وإعادة الدفء كما هو مفصل في هذا البروتوكول.
بعد إعادة تثلج الصدر قطرات الكبد vipatocyified سوف ينتهي بك الأمر مع تعليق التحجيم أفضل والتي يمكن استخدامها لذلك في جميع نفس الطرق كما لو كانت معزولة حديثا. وكطريقة محسنة للحفظ، قد يزيد التزجيج الزُكَني السائب من توافر الـ pri-ma للأبحاث والتطبيقات السريرية.
