Vitrifikation wird in der Regel durch Toxizität von kryoprotektive Mittel behandelt. Und wieder in kleine Proben eingefügt, die schnell gekühlt werden können. Dieses Protokoll ermöglicht die Verglasung großer Zellmengen bei gleichzeitig geringer CPA-Konzentration während der Vorinkubation.
Durch schnelle osmotische Dehydrierung wird der niedrige Zwischenkeller-CPA direkt vor der Vitrifizierung im Fluidgerät konzentriert. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, toxische CPA-Konzentrationen vollständig auszudemtzuführen. Bulk-Tropfen-Vitrifikation kann lebensfähige und metabolisch aktive Hepatozyten für die Verwendung von Hepatozyten Transplantation und bio-künstliche Leber-Geräte, die unsere derzeit durch unzureichende Ergebnisse nach Kryokonservierung behindert.
Diese Methode kann möglicherweise für die Verglasung anderer Zelltypen angepasst werden, die in großen Mengen kryokoniert werden müssen;z. B. Blutprodukte oder Stammzellen unter anderem. Um zu beginnen, machen Vitrifizierung Lösung 1 durch Hinzufügen von 40 Milligramm BSA zu 17,0 Milliliter der University of Wisconsin Solution. Verwenden Sie einen 0,22 Mikrometer-Filter, um die Lösung zu sterilisieren und bei vier Grad Celsius aufzubewahren.
Erstellen Sie Vitrifizierungslösung 2, wie im Protokoll beschrieben. Und steril es durch einen 0,22 Mikrometer Filter filtern. 3,5 Milliliter sterilgefilterte V2-Lösung in eine Drei-Milliliter-Spritze geben und bei vier Grad Celsius lagern.
Um die Bulk-Tröpfchen-Vitrifizierungsapparat vorzubereiten, zuerst entlang einer Seite der Mischnadeln äußere graue Hülse schneiden. Biegen Sie die Hülse auf, um sie von der Mischnadel zu entfernen. Schneiden Sie dann die Mischnadel auf eine Länge von 20 Millimetern und legen Sie ihren Cutoff-Auslass in eine 20-Spur-Injektionsnadel ein.
Schieben Sie zwei 25-Millimeter-Silizium-Schlauchabschnitte über die Einlässe der Mischnadel. Und sichern Sie ihre Position mit Kleber. Sterilisieren Sie diese Baugruppe durch Autoklavieren.
Füllen Sie einen sterilen Dewar-Kolben mit flüssigem Stickstoff. Und sterilisieren Sie die Außenseite mit Isopropanol, bevor Sie es in eine sterile Laminer-Flow-Zell-Kulturhaube legen. Achten Sie darauf, geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen, da flüssiger Stickstoff schwere Verbrennungen verursachen kann.
Um die Tröpfchensammelvorrichtung zu erstellen, legen Sie einen Trichter mit dem gleichen Außendurchmesser wie der Innendurchmesser des Dewar in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Mit großen Zangen drücken Sie das Tröpfchensammelgerät langsam in den flüssigen Stickstoff in seiner endgültigen vertikalen Position. Stellen Sie sicher, dass das konische Rohr in vertikaler Position am unteren Rand des Dewar stagniert.
Und der Flüssigstickstoffgehalt ist einen Zentimeter niedriger als der Rand des Trichters. Um eine Spritzenpumpe an einer vertikalen Position an der Wand der Zellkulturhaube zu montieren, binden Sie eine Schnur von den Füßen der Spritzenpumpe an Schrauben, die aus der Zellkultur-Haubewand herausragen. Legen Sie dann den flüssigen Stickstoff Dewar mit der Tröpfchensammelvorrichtung unter die vertikal montierte Spritzenpumpe.
Nach Erhalt frisch isolierter Rattenhepatozyten, zählen Sie die Lagerkonzentration durch Tri-Pan-Blau-Ausschluss. Und übertragen Sie 40 Millionen lebensfähige Hepatozyten in eine 50 Milliliter konische Röhre. Zentrifugieren Sie die Hepatozyten bei 50 mal G für fünf Minuten ohne Pause.
Aspirieren Sie den Überstand. Setzen Sie die Hepatozyten in 3,4 Millilitern V1-Lösung wieder aus. Und drei Minuten auf Eis brüten.
Dann 150 Mikroliter DMSO und 150 Mikroliter EG hinzufügen; sanft mischen und drei Minuten lang wieder auf Eis brüten. 150 Mikroliter DMSO und 150 Mikroliter EG wieder zu den Hepatozyten geben und vorsichtig mischen. 3,5 Milliliter dieser Mischung in eine Drei-Milliliter-Spritze geben.
Setzen Sie die Spritze mit vorbebrüten Hepatozyten und die Spritze mit V2-Lösung auf den Spritzenpumpenadapter. Befestigen Sie zwei Buchsen-Schleuse-Adapter an den Spritzen. Und schieben Sie die Siliziumschläuche der Mischnadelbaugruppe über die Widerhakenarmaturen.
Legen Sie diese gesamte Baugruppe in die Spritzenpumpe. Drei Minuten nach der letzten Ausgabe von DMSO und EG zu den Hepatozyten, starten Sie die Pumpe mit zwei Milliliter pro Minute. Immerhin wurden dem flüssigen Stickstoff stopp die Pumpe Hepatozyten zugesetzt.
Mit einer 20-Spur-Nadel, punktieren Sie 10 kleine Löcher in den Deckel eines 50 Milliliter konischen Rohr. Und wickeln Sie die Außenseite des Deckels mit einem flexiblen Film, wodurch ein Ventil entsteht, das das Entweichen von verdampfendem flüssigem Stickstoff ermöglicht. Um die verglasten Hepatozytentröpfchen zu sammeln, entfernen Sie zuerst den Trichter aus dem Dewar mit flüssigem Stickstoff.
Als nächstes, mit langen Zangen, nehmen Sie das konische Rohr, das die Tröpfchen aus dem flüssigen Stickstoff enthält, und gießen Sie langsam den überschüssigen flüssigen Stickstoff aus dem konischen Rohr. Schließen Sie das konische Rohr mit dem durchlöcherten Deckel und legen Sie dann das geschlossene konische Rohr mit verglasten Hepatozytentröpfchen mit flüssigem Stickstoff direkt wieder in den Dewar. Schließlich übertragen Sie das konische Rohr aus dem flüssigen Stickstoff in einen flüssigen Stickstoffkrynotank.
Nach der Herstellung der Rewarming-Lösung mit Saccharose- und DMEM-Hepatozyten-Kulturmedien verwenden Sie einen 0,22-Mikrometer-Filter, um sie zu sterilisieren. Dann auf 37 Grad Celsius erwärmen. Um die Hepatozyten wieder aufzuwärmen, entfernen Sie das konische Rohr mit verglasten Hepatozyten aus dem Kryotank und transportieren es in einem flüssigen Stickstoff Dewar in die Subkulturhaube.
Lösen Sie die Kappe leicht und legen Sie das konische Rohr wieder in den flüssigen Stickstoff. Arbeiten Sie schnell, fügen Sie alle verglasten Hepatozytentröpfchen zu einem leeren Becher, dann fügen Sie schnell 100 Milliliter 37 Grad Celsius warmes Aufwärmlösung unter Rühren für 10 Sekunden. Wenn die Tröpfchen aus flüssigem Stickstoff entfernt werden, tritt das inest Einfrieren innerhalb von Sekunden auf, wenn die Tröpfchen nicht schnell wieder aufgewärmt werden.
Daher ist es wichtig, die Rewarming-Medien direkt zu den Tröpfchen hinzuzufügen, während sie rühren. Teilen Sie die Rewarminglösung mit Hepatozyten in zwei 50 Milliliter konische Schläuche auf. Zentrifugieren Sie die Rohre für zwei Minuten bei 100 mal G bei vier Grad Celsius ohne Pause.
Aspirieren Sie die Überstande, um ein Gesamtvolumen von 12,5 Millilitern zu hinterlassen, indem Sie die Graduierungsmarke der Röhre als Referenz verwenden. Um die Rewarming-Lösung zu 50% zu verdünnen, fügen Sie 12,5 Milliliter eiskaltes DMEM pro konischem Rohr hinzu. Drei Minuten lang wieder aufeisern und bebrüten.
Um die Rewarminglösung auf 25% zu verdünnen, fügen Sie 25 Milliliter eiskaltes DMEM pro konischem Rohr hinzu. Nach fünf Minuten zentrifugieren bei 50 mal G bei vier Grad Celsius ohne Pause, den Überstand ansaugen und die Hepatozyten in zwei Millilitern des gewünschten Kulturmediums wieder aussetzen. Gemessen durch Tri-Pan-Blau-Ausschluss-Tests, die die Membranintegrität bestimmt, führte die Massentropfenverglasung zu einer direkten Hepatozyten-Lebensfähigkeit nach der Konservierung von 79%. Dies war signifikant höher als die 68%ige Lebensfähigkeit nach klassischer optimierter Kryokonservierung.
Die Ausbeute der Bulk-Droplet-Vitrifizierung war 56%, was 10% höher und konsistenter als die klassische Kryokonservierung war. Mit Presto-Glue-Metabolisierungs-Assay in langfristigen College- und Sandwichkulturen wurde die metabolische Aktivität an den Hepatozyten gemessen, um nach der Massentröpfchenverglasung dann nach der klassischen Kryokonservierung deutlich höher zu sein. Albumin-Synthese, als der am weitesten verbreitete Parameter der synthetischen Funktion von Hepatozyten, war größer um fast das Zweifache nach Bulk-Droplet-Vitrifizierung, dann nach klassischer Kryokonservierung.
Die Harnstoffproduktion wurde verwendet, um die Entgiftungsfunktion von Hepatozyten in einer einwöchigen Kultur zu messen. In bulk droplet verglasten Hepatozyten war die Harnstoffproduktion deutlich höher als bei klassischen Kryokonservenhepatozyten. Für konsistente Ergebnisse nach der Verglasung von Bulk-Droplet ist es wichtig, genau dem Timing während der Vorinkubation von CPAs und dem erneuten Aufwärmen zu folgen, wie in diesem Protokoll beschrieben.
Nach dem Erneutaufwärmen der verglasten Hepatozytentröpfchen erhalten Sie am Ende eine bessere Größensuspension, die daher auf die gleiche Weise verwendet werden kann, als ob sie frisch isoliert wären. Als verbesserte Konservierungsmethode kann die Massentropfenverglasung die Verfügbarkeit für Forschung und klinische Anwendungen erhöhen.
