ガラス化は、典型的には、凍結保護剤の毒性によって処理される。そして、速く冷却することができる小さなサンプルに再挿入。このプロトコルは、プレインキュベーション中に低CPA濃度を使用しながら、大量の細胞のガラス化を可能にします。
急速な浸透性脱水を使用して、低セラーCPAは、ガラス化の真前に流体装置に集中する。これにより、有毒なCPA濃度を完全に平衡化する必要がなくなります。バルク液滴ガラス化は、凍結保存後の不十分な結果によって現在妨げとなっている肝細胞移植およびバイオ人工肝装置を使用するための生存可能かつ代謝的に活性な肝細胞を提供する可能性がある。
この方法は、血液製剤や幹細胞など、大量に凍結保存する必要がある他の細胞タイプのガラス化に適応する可能性があります。まず、ウィスコンシン大学ソリューションの17.0ミリリットルにBSAの40ミリグラムを追加することにより、ガラス化ソリューション1を作ります。0.22マイクロメートルのフィルターを使用して溶液を無菌でろ過し、摂氏4度で保存します。
プロトコルに記載されているように、ガラス化ソリューション2を作成する。そして、無菌は0.22マイクロメートルのフィルターを通してそれをフィルターします。3ミリリットルのシリンジに3.5ミリリットルの無菌濾過V2溶液をロードし、摂氏4度で保管します。
バルク液滴ガラス化装置を調製するために、まず、混合針の外側グレースリーブの片面に沿って切断する。袖を開けて、ミキシング針から取り除きます。その後、混合針を20ミリメートルの長さにカットし、そのカットオフ出口を20ゲージ注射針に挿入します。
25ミリメートルシリコンチューブセクションを混合針の入口の上にスライドさせます。そして、接着剤で自分の位置を確保します。オートクレーブ処理により、このアセンブリを殺菌します。
無菌のデュワーフラスコに液体窒素を充填します。そして、滅菌ラミナーフロー細胞培養フードに入れる前にイソプロパノールで外側を殺菌する。液体窒素は深刻な火傷を引き起こす可能性がありますので、適切な個人的な保護具を着用してください。
液滴回収装置を作成するには、50ミリリットル円錐形のチューブに、デュワーの内径と同じ外径の漏斗を挿入します。大きな鉗子を使用して、液滴回収装置を最後の垂直位置の液体窒素でゆっくりと押し下げます。円錐形のチューブがデュワーの底部の垂直位置に置かっていることを確認します。
そして、液体窒素レベルは漏斗の端よりも1センチメートル低いです。細胞培養フードの壁の垂直位置にシリンジポンプを取り付けるには、シリンジポンプの足から細胞培養フードの壁から突き出たネジにひもを結びます。次に、液体窒素デュワーを液滴回収装置とともに垂直に取り付けられたシリンジポンプの下に置きます。
分離したばかりのラット肝細胞を得た後、トリパンブルー排除によりストック濃度をカウントする。そして、50ミリリットル円錐形のチューブに4000万の実行可能な肝細胞を移す。50回Gで肝細胞を5分間休憩せずに遠心分離する。
上清を吸引する。V1溶液の3.4ミリリットルで肝細胞を再中断します。そして、3分間氷の上でインキュベートします。
その後、150マイクロリットルのDMSOと150マイクロリットルのEGを加え、穏やかに混ぜて氷の上で3分間インキュベートします。再び肝細胞に150マイクロリットルのDMSOと150マイクロリットルのEGを加え、穏やかに混ぜます。この混合物の3.5ミリリットルを3ミリリットルのシリンジに入れます。
事前インキュベート肝細胞とシリンジを挿入し、V2溶液を使用してシリンジをシリンジポンプアダプターに挿入します。2 つの女性ルアー ロック ホース バーブ アダプターを注射器に取り付けます。そして、バーブの付属品の上に混合針アセンブリのケイ素管をスライドさせます。
このアセンブリ全体をシリンジポンプに入れ最後の版のDMSOとEGから肝細胞までの3分後、毎分2ミリリットルでポンプを始動する。すべての肝細胞が液体窒素に添加された後、ポンプを停止します。
20ゲージ針を使用して、50ミリリットルの円錐管の蓋に10個の小さな穴を穿刺する。そして、柔軟なフィルムで蓋の外側を包み、残りの液体窒素を蒸発させる脱出を可能にするバルブを作成します。ガラス化肝細胞液滴を採取するには、まず液体窒素でデュワーから漏斗を取り除きます。
次に、長い鉗子で、液体窒素から液滴を含む円錐管を取り出し、円錐管から余分な液体窒素をゆっくりと注ぎ出す。穿刺された蓋で円錐管を閉じ、ガラス化肝細胞液滴を含む閉じた円錐管を液体窒素でデュワーに戻します。最後に、円錐管を液体窒素から液体窒素の凍結槽に移します。
ショ糖およびDMEM肝細胞培養培地で再温暖化液を作った後、0.22マイクロメートルのフィルターを使用して滅菌フィルターを使用する。その後、摂氏37度に温めます。肝細胞を再温するには、凍結タンクからガラス化肝細胞で円錐状のチューブを取り除き、液体窒素デュワーでサブカルチャーフードに輸送します。
キャップを軽く緩め、円錐管を液体窒素に戻します。迅速に作業し、空のビーカーにすべてのガラス化肝細胞液滴を追加し、10秒間攪拌しながら37°Cの暖かい再温暖化溶液の100ミリリットルを迅速に追加します。液滴が液体窒素から除去されると、液滴が急速に再温されない場合、エスト内凍結が数秒以内に起こる。
したがって、攪拌しながら液滴に再温暖化媒体を直接添加することが重要です。肝細胞で再温暖化液を2つの50ミリリットル円錐形チューブに分けます。チューブを100倍Gで2分間、4°Cで断気します。
上清を吸引し、チューブの卒業マークを基準として12.5ミリリットルの総体積を残す。再温暖化液を50%に希釈するには、円錐管あたり12.5ミリリットルの氷冷DMEMを加える。氷の上で3分間再中断してインキュベートします。
再温暖化溶液を25%に希釈するには、円錐管あたり25ミリリットルの氷冷DMEMを加える。50倍Gで5分間、4度のGで5分間、ブレークせずに、上清を吸引し、所望の培養培地の2ミリリットルで肝細胞を再懸濁する。膜の完全性を決定するトライパンブルー排除試験で測定した場合、バルク液滴ガラス化は直接保存後肝細胞生存率79%をもたらした。
バルク液滴ガラス化の収率は56%であり、これは古典的な凍結保存よりも10%高く、より一貫していた。長期の大学およびサンドイッチ培養におけるプレスト・グルー代謝アッセイを用いて、肝細胞における代謝活性は、バルク液滴ガラス化後、古典的凍結保存後に有意に高くなるように測定された。アルブミン合成は、肝細胞の合成機能の最も広く使用されているパラメータとして、バルク液滴ガラス化後、そして古典的な凍結保存後にほぼ2倍大きかった。
尿素生産は、1週間培養で肝細胞の解毒機能を測定するために使用された。バルク液滴のガラス化肝細胞では、尿素産生は古典的な凍結保存肝細胞のそれよりも有意に高かった。バルク液滴ガラス化後の一貫した結果を得るためには、CPAの事前インキュベーション中に正確にタイミングを追いかけ、このプロトコルで詳述されているように再温暖化することが重要です。
ガラス化肝細胞液滴を再温暖化した後、あなたはそれゆえに、彼らが新鮮に単離されたかのようにすべての同じ方法で使用することができるより良いサイジングサスペンションで終わるでしょう。改善された保存方法として、バルク液滴ガラス化は、研究および臨床応用のための利用可能性pri-maを増加させる可能性がある。
