유리화는 전형적으로 극저온보호제의 독성에 의해 처리된다. 그리고 빠르게 냉각 할 수있는 작은 샘플에 다시 삽입. 이 프로토콜은 배양 전 동안 낮은 CPA 농도를 사용하는 동안 대량의 진동을 가능하게 합니다.
빠른 삼투탈수를 사용하여, 낮은 지하실 간 CPA는 유리화바로 앞에 유체 장치에 집중됩니다. 이것은 완전히 독성 CPA 농도를 평형의 필요성을 제거합니다. 대량 물방울 진동은 간세포 이식 및 현재 냉동 보존 후 부적절한 결과에 의해 방해되는 생체 인공 간 장치를 사용하기위한 실행 가능하고 대사활성 간장을 제공 할 수 있습니다.
이 방법은 잠재적으로 다량에서 저온 보존될 필요가 있는 그밖 세포 모형의 유리화를 위해 적응될 수 있습니다;혈액 제품 또는 줄기 세포 와 같은 그 외의 사이에서. 시작하려면, 위스콘신 대학 솔루션의 17.0 밀리리터에 BSA의 40 밀리그램을 추가하여 바이트로피케이션 1을 확인하십시오. 0.22 마이크로미터 필터를 사용하여 용액을 멸균하고 섭씨 4도에 보관하십시오.
프로토콜에 설명된 대로 진동 솔루션 2를 만듭니다. 그리고 멸균 필터는 0.22 마이크로미터 필터를 통해 필터. 멸균 여과 된 V2 용액3.5 밀리리터를 3 밀리리터 주사기에 적재하고 섭씨 4도에 보관하십시오.
벌크 액적 진동 장치를 준비하려면 먼저 혼합 바늘의 한쪽을 따라 잘라 외부 회색 슬리브. 슬리브를 열어 믹싱 바늘에서 제거합니다. 그런 다음 혼합 바늘을 길이 20mm로 자르고 컷오프 콘센트를 20 게이지 주입 바늘에 삽입합니다.
혼합 바늘의 입구 위에 두 개의 25 밀리미터 실리콘 튜브 섹션을 밀어 넣습니다. 그리고 접착제로 자신의 위치를 확보. 자동 분해하여 이 어셈블리를 소독합니다.
멸균 드워 플라스크를 액체 질소로 채웁니다. 그리고 멸균 라미너 플로우 세포 배양 후드에 배치하기 전에 이소 프로파놀로 외부를 살균. 액체 질소가 심각한 화상을 입을 수 있으므로 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
액적 수집 장치를 만들려면 Dewar의 내지름과 동일한 외부 직경의 깔때기를 50 밀리리터 원추형 튜브에 삽입합니다. 큰 집게를 사용하여 최종 수직 위치에서 액체 질소에서 방울 수집 장치를 천천히 누릅니다. 원문 튜브가 드와르 바닥의 수직 위치에 있는지 확인합니다.
그리고 액체 질소 수준은 깔때기의 가장자리보다 1 센티미터 낮습니다. 셀 배양 후드의 벽에 수직 위치에 주사기 펌프를 장착하려면 주사기 펌프의 발에서 세포 배양 후드 벽에서 튀어나온 나사에 끈을 묶습니다. 그런 다음, 수직으로 장착된 주사기 펌프 아래에 액상 질소 드와르를 액적 수집 장치로 놓습니다.
갓 고립 된 쥐 간세포를 얻은 후, 삼판 파랑 배제에 의해 재고 농도를 계산합니다. 그리고 4천만 개의 가능한 간세포를 50 밀리리터 원내 튜브로 옮기습니다. 간세포는 50회 G로 분리하지 않고 5분간 원심분리합니다.
상체를 흡인합니다. V1 솔루션의 3.4 밀리리터에서 간구를 다시 중단합니다. 그리고 3 분 동안 얼음에 배양.
그런 다음 DMSO 150 마이크로리터와 150마이크로리터의 EG를 추가합니다.부드럽게 혼합하고 얼음에 다시 3분 동안 배양합니다. DMSO 150 마이크로리터와 150마이크로리터의 EG를 다시 간세포에 넣고 부드럽게 섞습니다. 3 밀리리터 주사기에 이 혼합물의 3.5 밀리리터를 적재합니다.
미리 배양된 간구체와 주사기를 V2 용액으로 주사기에 주사기 펌프 어댑터에 삽입합니다. 두 개의 여성 루어 록 호스-바브 어댑터를 주사기에 부착합니다. 그리고 바브 피팅 위에 혼합 바늘 어셈블리의 실리콘 튜브를 밀어.
이 전체 어셈블리를 주사기 펌프에 놓습니다. DMSO 및 EG의 마지막 버전이 간세포에 대한 3 분 후 분당 2 밀리리터로 펌프를 시작합니다. 결국 간세포가 액체 질소에 첨가되어 펌프를 중지합니다.
20 게이지 바늘을 사용하여 50 밀리리터 원추형 튜브의 뚜껑에 10 개의 작은 구멍을 뚫습니다. 그리고 뚜껑의 외부를 유연한 필름으로 감싸서 왼쪽 위에 액체 질소를 증발시키는 밸브를 만듭니다. 유리화 간세포 물방울을 수집하려면 먼저 액체 질소로 드와르에서 깔때기를 제거하십시오.
다음으로, 긴 집게로 액체 질소의 액적을 포함하는 원추형 튜브를 꺼내서 원추형 튜브에서 과도한 액체 질소를 천천히 부어 냅니다. 천공 된 뚜껑으로 원추형 튜브를 닫은 다음 액체 질소로 데와르에 유리화 된 간구 방울로 닫힌 원추형 튜브를 직접 배치하십시오. 마지막으로, 액체 질소에서 원물 튜브를 액체 질소 냉동탱크로 옮킨다.
자당 및 DMEM 간세포 배양 배지로 재웜 용액을 만든 후 0.22 마이크로미터 필터를 사용하여 필터를 멸균합니다. 그런 다음 섭씨 37도까지 데우겠습니다. 간세포가 냉동 탱크에서 유리화 된 간세포로 원물 튜브를 제거하고 액체 질소 드와르에서 하위 배양 후드로 운반합니다.
뚜껑을 가볍게 풀고 원추형 튜브를 액체 질소에 다시 놓습니다. 신속하게 작업하면 모든 유리화 된 간세포 방울을 빈 비커에 추가 한 다음 10 초 동안 교반하면서 섭씨 37도의 따뜻한 재집용 100 밀리리터를 신속하게 추가합니다. 액적들이 액체 질소 에서 제거되면 액적이 빠르게 다시 떼지 않으면 몇 초 이내에 동결이 발생합니다.
따라서 교반하는 동안 다시 웜 미디어를 물방울에 직접 추가하는 것이 중요합니다. 재웜 용액을 간세포로 두 개의 50 밀리리터 원내 튜브로 나눕니다. 튜브를 섭씨 4도에서 100회 G로 2분간 원심분리합니다.
슈퍼네이넌트는 튜브의 졸업 표시를 참조로 사용하여 총 12.5 밀리리터를 남길 수 있습니다. 재온 용액을 50%로 희석하려면 원추형 튜브당 12.5 밀리리터의 얼음 차가운 DMEM을 추가합니다. 3 분 동안 얼음에 다시 일시 중단하고 인큐베이션합니다.
재온 용액을 25%로 희석하려면 원추형 튜브당 25밀리리터의 얼음 차가운 DMEM을 추가합니다. 섭씨 4도에서 50회 G에서 5분간 원심분리한 후, 상퍼를 흡인하고 원하는 배양 배지의 2밀리리터로 간구를 다시 중단한다. 멤브레인 무결성을 결정하는 트라이 팬 블루 배제 테스트로 측정하면 벌크 방울 이질로 인해 직접 보존 후 간세포 생존 가능성이 79 %이 고전 최적화 된 냉동 보존 후 68 %의 생존력보다 현저히 높았습니다.
대량 물방울 진동의 수율은 56 %였는데 이는 고전적인 냉동 보존보다 10 % 높고 일관성이 있었습니다. 장기 대학 및 샌드위치 배양에서 프레스토 접착제 대사 분석 분석서를 사용하여, 간세포에서의 대사 활동은 고전적인 냉동 보존 후 대량 물방울 진동 후 상당히 높은 것으로 측정되었다. 알부민 합성, 간 세포의 합성 기능의 가장 널리 사용되는 매개 변수로, 대량 물방울 진동 후 거의 두 배에 의해 더 컸다, 다음 고전적인 냉동 보존 후.
우레아 생산은 1주일 배양에서 간세포 해독 기능을 측정하는 데 사용되었습니다. 대량 물방울에서 상종 간세포에서, 우레아 생산은 고전적인 냉동 보존 간세포에서보다 상당히 높았다. 대량 물방울 진동 후 일관된 결과를 위해 CPA의 사전 인큐베이션 동안 타이밍을 정확하게 따르고이 프로토콜에 자세히 설명된 대로 다시 데우는 것이 중요합니다.
유리화 된 간세포 물방울을 다시 데우면 더 나은 크기 조정 서스펜션으로 끝나므로 갓 고립 된 것처럼 모든 방식으로 사용할 수 있습니다. 개선된 보존 방법으로, 벌크 액적 진동은 연구 및 임상 응용을 위한 가용성 프리마를 증가시킬 수 있다.
