Vitrifikasyon genellikle kriyoprotektif ajanların toksisitesi ile işlenir. Ve hızlı soğutulabilen küçük numunelere tekrar yerleştirilir. Bu protokol, kuluçka öncesi dönemde düşük EBM konsantrasyonu kullanırken büyük hücre limiktarlarının vitrifikasyonunu sağlar.
Hızlı ozmotik dehidratasyon kullanılarak, düşük mahzenler arası CPA vitrifikasyon öncesinde sıvı cihazda yoğunlaşmıştır. Bu, toksik EBM konsantrasyonlarını tam olarak dengeleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Toplu damlacık vitrifikasyon, kriyopreservation sonrası yetersiz sonuçlar la engellenen hepatosit transplantasyonu ve biyo-yapay karaciğer cihazlarının kullanımı için uygun ve metabolik olarak aktif hepatositler sağlayabilir.
Bu yöntem potansiyel olarak büyük miktarlarda kriyo-korunması gereken diğer hücre tiplerinin vitrifikasyonu için uyarlanabilir;örneğin kan ürünleri veya kök hücreler gibi. Başlamak için, Wisconsin Üniversitesi Çözüm Üniversitesi 17.0 mililitre BSA 40 miligram ekleyerek vitrifikasyon Çözüm 1 olun. Çözeltiyi steril filtrelemek ve dört santigrat derecede depolamak için 0,22 mikrometre filtre kullanın.
Protokolde açıklandığı gibi vitrifikasyon Çözüm 2 yapın. Ve steril filtre 0.22 mikrometre filtre ile. Üç mililitrelik şırıngada 3,5 mililitre steril filtrelenmiş V2 Solüsyonu yükleyin ve dört santigrat derecede saklayın.
Toplu damlacık vitrifikasyon aparatını hazırlamak için, ilk olarak, karıştırma iğneleri dış gri kollu bir tarafı boyunca kesilmiş. Karıştırma iğnesinden çıkarmak için kılıfı açık bükün. Daha sonra, karıştırma iğnesini 20 milimetre uzunluğunda kesin ve kesme çıkışını 20 gauge enjeksiyon iğnesine takın.
Karıştırma iğnesinin girişlerinin üzerine iki 25 milimetrelik silikon boru kesitlerini kaydırın. Ve pozisyonlarını tutkalla sabitleyin. Otoklavlayarak bu montajı sterilize edin.
Steril bir Dewar şişeyi sıvı nitrojenle doldurun. Ve steril bir Laminer akış hücre kültürü başlık yerleştirmeden önce izopropanol ile dış sterilize. Sıvı nitrojen ciddi yanıklara neden olabilir gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giymek emin olun.
Damlacık toplama cihazı oluşturmak için 50 mililitre konik tüp içine, Dewar iç çapı ile aynı dış çapı ile bir huni ekleyin. Büyük forceps kullanarak, damlacık toplama cihazını son dikey pozisyonunda sıvı nitrojenle yavaşça aşağı doğru bastırın. Konik tüpün Dewar'ın alt kısmında dikey konumda olduğundan emin olun.
Ve sıvı nitrojen seviyesi huninin kenarından bir santimetre daha düşüktür. Hücre kültürü başlık duvarında dikey bir pozisyonda bir şırınga pompası monte etmek için, hücre kültürü başlık duvardan çıkıntılı vidalar için şırınga pompası ayaklarından bir dize kravat. Daha sonra, dikey monte şırınga pompası altında damlacık toplama cihazı ile sıvı nitrojen Dewar yerleştirin.
Taze izole sıçan hepatositler elde ettikten sonra, tri-pan mavi dışlama ile stok konsantrasyonu saymak. Ve 40 milyon canlı hepatositi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hepatositleri 50 kez G'de beş dakika ara vermeden santrifüj edin.
Süpernatant aspire. V1 Solution'ın 3,4 mililitresinde hepatositleri yeniden askıya alın. Ve üç dakika boyunca buzda kuluçkaya yat.
Daha sonra, 150 mikrolitre DMSO ve 150 mikrolitre EG ekleyin;hafifçe karıştırın ve üç dakika boyunca tekrar buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Hepatositlere 150 mikrolitre DMSO ve 150 mikrolitre EG ekleyin ve hafifçe karıştırın. Üç mililitrelik şırınga bu karışımın 3,5 mililitre yükleyin.
Şırıngayı önceden kuluçkaya yatan hepatositlerle ve V2 Solüsyonu ile şırınga pompa adaptörüne yerleştirin. Şırıngalara iki Dişi Luer Lock hortum-barb adaptörü takın. Ve karıştırma iğne montaj silikon boru diken parçaları üzerinde kaydırın.
Tüm bu montajı şırınga pompasına yerleştirin. DMSO ve EG'nin hepatositlere son baskısından üç dakika sonra, pompayı dakikada iki mililitreden başlatın. Tüm hepatositler sıvı nitrojen pompa durdurmak eklenmiştir sonra.
20 gauge iğne kullanarak, 50 mililitrelik konik bir tüpün kapağında 10 küçük delik açın. Ve esnek bir film ile kapağın dışında sarın, sol sıvı azot buharlaşma kaçış sağlayacak bir vana oluşturarak. Vitrifiye hepatosit damlacıkları toplamak için, ilk sıvı nitrojen ile Dewar hunisi çıkarın.
Daha sonra, uzun forceps ile, sıvı nitrojen damlacıkları içeren konik tüp çıkarmak ve yavaş yavaş konik tüp aşırı sıvı nitrojen dökün. Konik tüpü delinmiş kapakla kapatın ve kapalı konik tüpü doğrudan sıvı nitrojenle Dewar'a vitrifiye hepatosit damlacıklarıyla yerleştirin. Son olarak, konik tüpü sıvı nitrojenden sıvı nitrojen kriyotanka aktarın.
Sakaroz ve DMEM hepatosit kültür ortamı ile yeniden Isınma çözeltisi yaptıktan sonra steril filtre için 0,22 mikrometre filtre kullanın. Sonra 37 santigrat dereceye ısıtın. Hepatositleri yeniden ısıtmak için konik tüpü vitrifiye hepatositlerle kriyoktan çıkarın ve sıvı nitrojen Dewar ile alt kültür başlığına taşıyın.
Kapağı hafifçe gevşetin ve konik tüpü sıvı nitrojene geri yerleştirin. Hızlı çalışma, boş bir kabın tüm vitrifiye hepatosit damlacıkları ekleyin, sonra hızlı bir şekilde 10 saniye karıştırarak 37 derece Santigrat sıcak ısınma çözeltisi 100 mililitre ekleyin. Damlacıklar sıvı nitrojenden çıkarıldığında en derin dondurucu soğuklar saniyeler içinde gerçekleşir, eğer damlacıklar hızla ısınmazsa.
Bu nedenle, karıştırma sırasında damlacıklara yeniden ısınma ortamını doğrudan eklemek çok önemlidir. Hepatositlerle yeniden Isınma çözeltisini 50 mililitrelik konik tüplere bölün. Tüpleri 100 kez G'de dört santigrat derecede iki dakika santrifüj edin.
Referans olarak tüpün mezuniyet işaretini kullanarak toplam 12,5 mililitre hacim bırakmak için süpernatants aspire. Isınma çözeltisini %50'ye seyreltmek için konik tüp başına 12,5 mililitre buz gibi donan DMEM ekleyin. Yeniden askıya alın ve üç dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yat.
Isınma çözeltisini %25'e seyreltmek için konik tüp başına 25 mililitre buz gibi donan DMEM ekleyin. Mola vermeden 4 derece 50 kez G beş dakika santrifüj sonra, supernatant aspire ve istenilen kültür ortamının iki mililitre hepatosit yeniden askıya. Membran bütünlüğünü belirleyen üçlü mavi dışlama testi ile ölçüldüğünde, toplu damlacık vitrifikasyonu doğrudan koruma sonrası hepatosit canlılığı %79 sonuçlandı bu klasik optimize kriyopreservation sonrası %68'lik canlılıktan önemli ölçüde daha yüksekti.
Toplu damlacık vitrifikasyon verimi% 56 olan% 10 daha yüksek ve klasik kriyopreservation daha tutarlı idi. Uzun süreli üniversite ve sandviç kültürlerinde presto-tutkal metabolizasyon teşheciliği kullanılarak, hepatositlerde metabolik aktivite, klasik kriyopreservation sonra toplu damlacık vitrifikasyon sonra önemli ölçüde daha yüksek olarak ölçüldü. Albumin sentezi, hepatositlerin sentetik fonksiyonunun en yaygın kullanılan parametresi olarak, toplu damlacık vitrifikasyon sonra yaklaşık iki kat daha büyük oldu, sonra klasik kriyopreservation sonra.
Üre üretimi bir haftalık kültürde hepatosit detoksifikasyon fonksiyonunu ölçmek için kullanılmıştır. Dökme damlacık vitrifiye hepatositlerde üre üretimi klasik kriyotosit hepatositlerden önemli ölçüde daha yüksekti. Toplu damlacık vitrifikasyonundan sonra tutarlı sonuçlar elde etmek için, EBM'lerin kuluçka öncesi dönemdeki zamanlamanın ve bu protokolde ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde yeniden ısınmanın tam olarak takip edilmesi önemlidir.
Vitrifiye hepatosit damlacıkları yeniden ısıttıktan sonra, daha iyi bir boyutlandırma süspansiyonu ile sona erecek ve bu da sanki taze izole edilmiş gibi aynı şekilde kullanılabilir. Geliştirilmiş bir koruma yöntemi olarak, toplu damlacık vitrifikasyon araştırma ve klinik uygulamalar için kullanılabilirlik pri-ma artırabilir.
