La vetrificazione è tipicamente gestita dalla tossicità degli agenti crioprotettivi. E re-inserito in piccoli campioni che possono essere raffreddati velocemente. Questo protocollo consente la vetrificazione di grandi quantità di cellule durante l'utilizzo di una bassa concentrazione di CPA durante la pre-incubazione.
Utilizzando una rapida disidratazione osmotica, il CPA a bassa inter cellar viene concentrato nel dispositivo fluido direttamente prima della vetrificazione. Ciò elimina la necessità di concentrazioni di CPA tossiche completamente equilibrati. La vetrificazione delle goccioline sfuse può fornire epatociti vitali e metabolicamente attivi per l'uso di trapianti di epatociti e dispositivi epatici bio-artificiali che attualmente siamo ostacolati da esiti inadeguati dopo la crioconservazione.
Questo metodo può potenzialmente essere adattato per la vetrificazione di altri tipi di cellule che devono essere crioconsenti in grandi quantità, come gli emoderivi o le cellule staminali, tra gli altri. Per iniziare, fare la soluzione di vetrificazione 1 aggiungendo 40 milligrammi di BSA a 17,0 millilitri di soluzione dell'Università del Wisconsin. Utilizzare un filtro da 0,22 micrometri per filtrare sterilemente la soluzione e conservare a quattro gradi Celsius.
Effettuare la soluzione di vetrificazione 2 come descritto nel protocollo. E sterile filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 micrometri. Caricare 3,5 millilitri di soluzione V2 filtrata sterile in una siringa da tre millilitri e conservare a quattro gradi Celsius.
Per preparare l'apparato di vetrificazione delle goccioline sfuse, in primo luogo, tagliare lungo un lato della manica grigia esterna degli aghi di miscelazione. Piegare il manicotto aperto per rimuoverlo dall'ago di miscelazione. Quindi, tagliare l'ago di miscelazione a una lunghezza di 20 millimetri e inserire la sua uscita di taglio in un ago di iniezione calibro 20.
Far scorrere due sezioni di tubi di silicio da 25 millimetri sopra le entrate dell'ago di miscelazione. E assicurarsi la loro posizione con la colla. Sterilizzare questo assemblaggio in autoclave.
Riempire un pallone Dewar sterile con azoto liquido. E sterilizzare l'esterno con isopropanolo prima di posizionare in una cappa sterile per la coltura di cellule di flusso Laminer. Assicurarsi di indossare dispositivi di protezione individuale appropriati in quanto l'azoto liquido può causare gravi ustioni.
Per creare il dispositivo di raccolta goccioline inserire un imbuto con lo stesso diametro esterno del diametro interno del Dewar, in un tubo conico da 50 millilitri. Utilizzando forcep di grandi dimensioni, premere lentamente il dispositivo di raccolta delle goccioline verso il basso nell'azoto liquido nella sua posizione verticale finale. Assicurarsi che il tubo conico poggia in posizione verticale nella parte inferiore del Dewar.
E il livello di azoto liquido è inferiore di un centimetro rispetto al bordo dell'imbuto. Per montare una pompa per siringhe in posizione verticale sulla parete del cappuccio di coltura cellulare, legare una corda dai piedi della pompa della siringa alle viti sporgenti dalla parete del cofano di coltura cellulare. Quindi, posizionare l'azoto liquido Dewar con il dispositivo di raccolta delle goccioline sotto la pompa della siringa montata verticalmente.
Dopo aver ottenuto epatociti di ratto appena isolati, contare la concentrazione dello stock per esclusione blu tri-pan. E trasferire 40 milioni di epatociti vitali in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare gli epatociti a 50 volte G per cinque minuti senza pausa.
Aspirare il supernatante. Sospendere di nuovo gli epatociti in 3,4 millilitri di soluzione V1. E incubare sul ghiaccio per tre minuti.
Quindi, aggiungere 150 microlitri di DMSO e 150 microlitri di EG;mescolare delicatamente e incubare nuovamente sul ghiaccio per tre minuti. Aggiungere nuovamente 150 microlitri di DMSO e 150 microlitri di EG agli epatociti e mescolare delicatamente. Caricare 3,5 millilitri di questa miscela in una siringa da tre millilitri.
Inserire la siringa con epatociti pre-incubati e la siringa con soluzione V2 sull'adattatore della pompa della siringa. Attaccare due adattatori femmina Luer Lock per tubi-barbe alle siringhe. E far scorrere il tubo di silicio del gruppo dell'ago di miscelazione sui raccordi per barbe.
Posizionare l'intero gruppo nella pompa della siringa. Tre minuti dopo l'ultima edizione di DMSO ed EG agli epatociti, avviare la pompa a due millilitri al minuto. Dopo che tutti gli epatociti sono stati aggiunti all'azoto liquido fermare la pompa.
Utilizzando un ago calibro 20, forare 10 piccoli fori nel coperchio di un tubo conico da 50 millilitri. E avvolgere l'esterno del coperchio con una pellicola flessibile, creando una valvola che consentirà la fuoriuscita di azoto liquido sinistro evaporante. Per raccogliere le goccioline di epatociti vetrificate, rimuovere prima l'imbuto dal Dewar con azoto liquido.
Successivamente, con lunghe forcep, eserti dal tubo conico che contiene le goccioline dall'azoto liquido e versare lentamente l'azoto liquido in eccesso dal tubo conico. Chiudere il tubo conico con il coperchio perforato e quindi posizionare direttamente il tubo conico chiuso con goccioline di epatociti vetrificate nel Dewar con azoto liquido. Infine, trasferire il tubo conico dall'azoto liquido in un criotank di azoto liquido.
Dopo aver fatto la soluzione di riscaldamento con saccarosio e mezzi di coltura di epatociti DMEM, utilizzare un filtro da 0,22 micrometri per filtrarlo sterile. Quindi scaldarlo a 37 gradi Celsius. Per riciclare gli epatociti rimuovere il tubo conico con epatociti vetrificati dal criotank e trasportarlo in azoto liquido Dewar nella cappa della sottocultura.
Allentare leggermente il tappo e riposizionare il tubo conico nell'azoto liquido. Lavorando rapidamente, aggiungere tutte le goccioline di epatociti vetrificate a un becher vuoto, quindi aggiungere rapidamente 100 millilitri di 37 gradi Celsius soluzione di riscaldamento caldo mescolando per 10 secondi. Quando le goccioline vengono rimosse dal congelamento intra-est dell'azoto liquido si verifica in pochi secondi se le goccioline non vengono rapidamente ririvissé.
Pertanto, è fondamentale aggiungere direttamente il supporto di riscaldamento alle goccioline durante l'agitazione. Dividere la soluzione di riscaldamento con epatociti in due tubi conici da 50 millilitri. Centrifugare i tubi per due minuti a 100 volte G a quattro gradi Celsius senza rottura.
Aspirare i supernatanti a lasciare un volume totale di 12,5 millilitri utilizzando il marchio di graduazione del tubo come riferimento. Per diluire la soluzione di riscaldamento al 50% aggiungere 12,5 millilitri di DMEM ghiacciato per tubo conico. Sospendere e incubare sul ghiaccio per tre minuti.
Per diluire la soluzione di riscaldamento al 25% aggiungere 25 millilitri di DMEM ghiacciato per tubo conico. Dopo aver centrifugato per cinque minuti a 50 volte G a quattro gradi Celsius senza rottura, aspirare il supernatante e sospendere di nuovo gli epatociti in due millilitri del mezzo di coltura desiderato. Se misurata dai test di esclusione blu tri-pan, che determinano l'integrità della membrana, la vetrificazione delle goccioline sfuse ha portato a una vitalità diretta degli epatociti post-conservazione del 79%Questo è stato significativamente superiore alla vitalità del 68% dopo la classica crioconservazione ottimizzata.
La resa della vetrificazione delle goccioline sfuse è stata del 56%, superiore del 10% e più consistente rispetto alla crioconservazione classica. Utilizzando il saggio di metabolizzazione presto-colla nelle colture universitarie e sandwich a lungo termine, l'attività metabolica negli epatociti è stata misurata per essere significativamente più alta dopo la vetrificazione delle goccioline alla rinfusa, quindi dopo la crioconservazione classica. La sintesi dell'albumina, come parametro più utilizzato della funzione sintetica degli epatociti, era maggiore di quasi due volte dopo la vetrificazione delle goccioline sfuse, quindi dopo la classica crioconservazione.
La produzione di urea è stata utilizzata per misurare la funzione di disintossicazione degli epatociti in una cultura di una settimana. Negli epatociti vetrificati a goccia sfusa, la produzione di urea era significativamente superiore a quella degli epatociti crioconservati classici. Per risultati coerenti dopo la vetrificazione delle goccioline sfuse è importante seguire esattamente i tempi durante la pre-incubazione degli APC e il riscaldamento come descritto in questo protocollo.
Dopo aver ritoritoritorito le goccioline di epatociti vetrificate si finirà con una migliore sospensione di dimensionamento che quindi può essere utilizzata in tutti gli stessi modi in cui se fossero appena isolate. Come metodo di conservazione migliorato, la vetrificazione delle goccioline sfuse può aumentare la disponibilità di pri-ma per la ricerca e le applicazioni cliniche.
