玻璃化通常由低温保护剂的毒性处理。并重新插入小样品，可以快速冷却。该协议允许在预孵化期间使用低 CPA 浓度，实现大细胞数量的玻璃化。
使用快速渗透脱水，低地间CPA集中在流体装置直接在玻璃化之前。这消除了完全平衡有毒CPA浓度的需要。散装液滴玻璃化可能提供可行和代谢活性的肝细胞，用于使用肝细胞移植和生物人工肝脏设备，我们目前因低温保存后的结果不足而受阻。
这种方法可能适用于需要大量冷冻保存的其他细胞类型的玻璃化，如血液制品或干细胞等。首先，通过向威斯康星大学溶液的 17.0 毫升中添加 40 毫克 BSA 来制造玻璃化解决方案 1。使用 0.22 微米过滤器对溶液进行无菌过滤，并储存在 4 摄氏度。
使玻璃化解决方案2如协议中所述。无菌过滤它通过0.22微米过滤器。将 3.5 毫升无菌过滤 V2 溶液装在三毫升注射器中，储存在 4 摄氏度内。
要准备散装液滴玻璃化装置，首先，沿着混合针的一侧切割外灰色套筒。将套筒弯曲开以将其从混合针上拆下。然后，将混合针切割成 20 毫米的长度，并将其切断出口插入 20 量表注射针中。
将两个 25 毫米硅管部分滑过混合针的入口。用胶水固定他们的位置。通过高压灭菌对该组件进行灭菌。
用液氮填充无菌的德瓦尔烧瓶。在将异丙醇放入无菌的拉明纳流动细胞培养罩中之前，先用异丙醇对外部进行消毒。确保穿戴适当的个人防护设备，因为液氮可能导致严重烧伤。
要创建液滴收集装置，请将与 Dewar 内径相同的漏斗插入 50 毫升锥形管中。使用大钳子，缓慢地将液滴收集装置压在液氮中，在其最终垂直位置。确保锥形管位于德瓦尔底部的垂直位置。
液氮水平比漏斗边缘低一厘米。要将注射器泵安装在细胞培养罩壁上的垂直位置，请将注射器泵脚上的一根绳子系在从细胞培养罩壁上伸出的螺钉上。然后，将液氮 Dewar 与液滴收集装置放在垂直安装的注射器泵下。
在获得新鲜分离的大鼠肝细胞后，通过三泛蓝排除计算库存浓度。将4000万个可行的肝细胞转移到50毫升锥形管中。将肝细胞在50倍G下离心5分钟，不中断。
吸上一道。在 V1 溶液的 3.4 毫升中重新悬浮肝细胞。在冰上孵育三分钟。
然后，加入150微升DMSO和150微升EG;轻轻混合，再在冰上孵育3分钟。再次向肝细胞中加入 150 微升的 DMSO 和 150 微升的 EG，然后轻轻混合。在三毫升注射器中装载3.5毫升的混合物。
将带预孵化的肝细胞的注射器和带 V2 溶液的注射器插入注射器泵适配器上。将两个母式 Luer Lock 软管-bar 适配器连接到注射器。将混合针组件的硅管滑过棒接头。
将整个组件放在注射器泵中。最后一版DMSO和EG到肝细胞后三分钟，以每分钟两毫升的速度启动泵。毕竟肝细胞被添加到液氮停止泵。
使用 20 测量针，刺穿 50 毫升锥形管盖上的 10 个小孔。用柔性薄膜包裹盖子外，形成一个阀门，使蒸发的液体氮逸出。要收集玻璃化的肝细胞液滴，首先用液氮从德瓦尔中去除漏斗。
接下来，用长钳，拿出含有液氮液滴的锥形管，慢慢从锥形管中倒出多余的液氮。用被刺穿的盖子关闭锥形管，然后用液氮直接将带玻璃化的肝细胞液滴的封闭圆锥管放回Dewar中。最后，将锥形管从液氮转移到液氮冷冻罐中。
使用蔗糖和DMEM肝细胞培养基进行再温溶液后，使用0.22微米过滤器进行无菌过滤。然后加热到37摄氏度。重新温暖肝细胞，将具有玻璃化的肝细胞从低温罐中去除锥形管，并将其用液氮 Dewar 运输到亚培养罩中。
轻轻松开盖子，将锥形管放回液氮中。快速工作，将所有玻璃化的肝细胞液滴添加到空烧杯中，然后快速加入 100 毫升 37 摄氏度的暖加热溶液，同时搅拌 10 秒。当液滴从液氮中去除，如果液滴没有迅速重新警告，在几秒钟内就会出现。
因此，在搅拌时直接将重新温温介质添加到液滴中至关重要。将用肝细胞重新温块溶液分成两个50毫升的圆锥管。在4摄氏度下在100倍G下离心管2分钟，不中断。
用管子的毕业标记作为参考，使超自然剂留下12.5毫升的总体积。将重新温热溶液稀释至50%，每锥形管添加12.5毫升冰冷DMEM。在冰上重新悬浮和孵育三分钟。
将重新温热溶液稀释至25%，每锥管添加25毫升冰冷DMEM。在4摄氏度下在50°G下离心5分钟后，吸升液，并在所需培养基的两毫升中重新悬浮肝细胞。通过三泛蓝排除测试（确定膜完整性）进行测量时，散装液滴玻璃化导致直接保存后肝细胞的生存能力为79%，这明显高于经典优化冷冻保存后68%的生存能力。
散装液滴玻璃化的产量为56%，比经典低温保存率高10%，更一致。在长期大学和三明治培养中，使用前粘胶代谢测定，在体积液滴玻璃化后，在经典冷冻保存之后，对肝细胞的代谢活性测量显著较高。白蛋白合成作为肝细胞合成功能最广泛使用的参数，在散装液滴玻璃化后，经过传统的低温保存，其体积增加了近两倍。
尿素生产用于测量一周培养的肝细胞解毒功能。在散装液滴玻璃化肝细胞中，尿素的产生明显高于经典冷冻库肝细胞。为了在批量液滴玻璃化后取得一致的结果，在注册会计师的预孵化过程中准确遵循时机并按照本协议中详述的重新预热非常重要。
重新温暖玻璃化的肝细胞液滴后，你最终会得到一个更好的大小悬浮液，因此可以使用所有相同的方式，如果他们是新鲜分离。作为一种改进的保存方法，散装液滴玻璃化可能会增加研究和临床应用的可用性。
