La vitrification est généralement traitée par la toxicité des agents cryoprotecteurs. Et réinséré à de petits échantillons qui peuvent être refroidis rapidement. Ce protocole permet la vitrification de grandes quantités cellulaires tout en utilisant une faible concentration de CPA pendant la pré-incubation.
Utilisant la déshydratation osmotique rapide, le CPA inter-cave bas est concentré dans le dispositif fluide directement avant la vitrification. Cela élimine la nécessité d’équilibrer complètement les concentrations toxiques de CPA. La vitrification de gouttelette en vrac peut fournir des hépatocytes viables et métaboliquement actifs pour l’utilisation de la transplantation d’hépatocytes et des dispositifs bio-artificiels de foie que notre actuellement entravé par des résultats inadéquats après cryopréservation.
Cette méthode peut potentiellement être adaptée à la vitrification d’autres types de cellules qui doivent être cryo-conservés en grandes quantités; tels que les produits sanguins ou les cellules souches, entre autres. Pour commencer, faire la solution de vitrification 1 en ajoutant 40 milligrammes de BSA à 17,0 millilitres de l’Université du Wisconsin Solution. Utilisez un filtre de 0,22 micromètre pour filtrer stérilement la solution et la conserver à quatre degrés Celsius.
Faire vitrification Solution 2 tel que décrit dans le protocole. Et filtre stérile à travers un filtre de 0,22 micromètre. Chargez 3,5 millilitres de solution V2 filtrée stérilement dans une seringue de trois millilitres et stockez-les à quatre degrés Celsius.
Pour préparer l’appareil de vitrification de gouttelette en vrac, d’abord, couper le long d’un côté de la manche grise extérieure des aiguilles de mélange. Pliez la manche ouverte pour l’enlever de l’aiguille à mélanger. Ensuite, coupez l’aiguille de mélange à une longueur de 20 millimètres et insérez sa prise de coupure dans une aiguille d’injection de calibre 20.
Glissez deux sections de tubes en silicium de 25 millimètres sur les entrées de l’aiguille de mélange. Et fixez leur position avec de la colle. Stériliser cet assemblage en autoclavant.
Remplir un flacon stérile de Dewar d’azote liquide. Et stériliser l’extérieur avec de l’isopropanol avant de le placer dans une hotte stérile de culture laminer flow-cell. Assurez-vous de porter l’équipement de protection individuelle approprié car l’azote liquide peut causer de graves brûlures.
Pour créer le dispositif de collecte des gouttelettes insérer un entonnoir avec le même diamètre extérieur que le diamètre intérieur de la Dewar, dans un tube conique de 50 millilitres. À l’aide de gros forceps, appuyez lentement sur le dispositif de collecte des gouttelettes dans l’azote liquide dans sa position verticale finale. Assurez-vous que le tube conique repose en position verticale au fond de la Dewar.
Et le niveau d’azote liquide est inférieur d’un centimètre au bord de l’entonnoir. Pour monter une pompe de seringue à une position verticale sur le mur du capot de culture cellulaire, attachez une corde des pieds de la pompe de seringue aux vis qui dépassent du mur de capot de culture cellulaire. Ensuite, placez l’azote liquide Dewar avec le dispositif de collecte des gouttelettes sous la pompe à seringues montée verticalement.
Après avoir obtenu des hépatocytes de rat fraîchement isolés, comptez la concentration de stock par exclusion bleue de tri-casserole. Et transférer 40 millions d’hépatocytes viables dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger les hépatocytes à 50 fois G pendant cinq minutes sans pause.
Aspirez le surnatant. Suspendre à nouveau les hépatocytes en 3,4 millilitres de solution V1. Et incuber sur la glace pendant trois minutes.
Ajouter ensuite 150 microlitres de DMSO et 150 microlitres d’EG; mélanger doucement et incuber à nouveau sur la glace pendant trois minutes. Ajouter 150 microlitres de DMSO et 150 microlitres d’EG aux hépatocytes à nouveau et mélanger délicatement. Charger 3,5 millilitres de ce mélange dans une seringue de trois millilitres.
Insérez la seringue avec des hépatocytes pré-incubés et la seringue avec solution V2 sur l’adaptateur de la pompe à seringues. Attachez deux adaptateurs femelles luer lock hose-barb aux seringues. Et faites glisser le tube de silicium de l’assemblage de l’aiguille de mélange sur les raccords de barbe.
Placez tout cet assemblage dans la pompe à seringues. Trois minutes après la dernière édition de DMSO et EG aux hépatocytes, démarrez la pompe à deux millilitres par minute. Après que tous les hépatocytes ont été ajoutés à l’azote liquide arrêter la pompe.
À l’aide d’une aiguille de calibre 20, percer 10 petits trous dans le couvercle d’un tube conique de 50 millilitres. Et envelopper l’extérieur du couvercle avec un film flexible, créant une valve qui permettra d’échapper à l’évaporation de l’azote liquide laissé sur. Pour recueillir les gouttelettes vitrifiées d’hépatocyte, retirez d’abord l’entonnoir du Dewar avec de l’azote liquide.
Ensuite, avec de longues forceps, sortez le tube conique qui contient les gouttelettes de l’azote liquide, et versez lentement l’excès d’azote liquide du tube conique. Fermez le tube conique avec le couvercle perforé, puis placez directement le tube conique fermé avec des gouttelettes d’hépatocyte vitrifiées dans le Dewar avec de l’azote liquide. Enfin, transférer le tube conique de l’azote liquide dans un cryotank d’azote liquide.
Après avoir fait la solution de réchauffage avec le saccharose et les supports de culture d’hépatocytes DMEM, utilisez un filtre de 0,22 micromètre pour le filtrer stérilement. Ensuite, réchauffez-le à 37 degrés Celsius. Pour réchaheurer les hépatocytes enlever le tube conique avec des hépatocytes vitrifiés du cryotank et le transporter dans un dewar d’azote liquide à la hotte de sous-culture.
Relâchez légèrement le bouchon et placez le tube conique dans l’azote liquide. En travaillant rapidement, ajoutez toutes les gouttelettes vitrifiées d’hépatocyte à un bécher vide, puis ajoutez rapidement 100 millilitres de solution de réchauffage chaud de 37 degrés Celsius tout en remuant pendant 10 secondes. Lorsque les gouttelettes sont retirées de l’azote liquide intra-est congélation se produit en quelques secondes si les gouttelettes ne sont pas rapidement réchaurées.
Par conséquent, il est essentiel d’ajouter directement le média réchaurant aux gouttelettes tout en remuant. Divisez la solution de réchamation avec des hépatocytes en deux tubes coniques de 50 millilitres. Centrifuger les tubes pendant deux minutes à 100 fois G à quatre degrés Celsius sans pause.
Aspirez les supernatants à laisser un volume total de 12,5 millilitres en utilisant la marque de graduation du tube comme référence. Pour diluer la solution de réchauration à 50%, ajoutez 12,5 millilitres de DMEM glacé par tube conique. Suspendre et incuber sur la glace pendant trois minutes.
Pour diluer la solution de réchauration à 25%, ajoutez 25 millilitres de DMEM glacé par tube conique. Après avoir centrifugé pendant cinq minutes à 50 fois G à quatre degrés Celsius sans pause, aspirer le supernatant et suspendre à nouveau les hépatocytes en deux millilitres du milieu de culture désiré. Lorsqu’elle est mesurée par des tests d’exclusion bleu tri-pan, qui détermine l’intégrité de la membrane, la vitrification des gouttelettes en vrac a entraîné une viabilité directe des hépatocytes post-préservation de 79 %, ce qui était significativement plus élevé que la viabilité de 68 % après cryopréservation optimisée classique.
Le rendement de la vitrification des gouttelettes en vrac était de 56 %, ce qui était 10 % plus élevé et plus constant que la cryopréservation classique. Utilisant l’essai de métabolisation de presto-colle dans les cultures à long terme d’université et de sandwich, l’activité métabolique aux hépatocytes a été mesurée pour être sensiblement plus élevée après vitrification de gouttelette en vrac puis après cryopreservation classique. La synthèse d’albumine, comme paramètre le plus largement employé de la fonction synthétique des hépatocytes, était plus grande par presque deux fois après vitrification de gouttelette en vrac, puis après cryopreservation classique.
La production d’urée a été utilisée pour mesurer la fonction de désintoxication des hépatocytes dans une culture d’une semaine. Chez les hépatocytes vitrifiés de gouttelettes en vrac, la production d’urée était significativement plus élevée que celle des hépatocytes cryopréservés classiques. Pour obtenir des résultats cohérents après la vitrification des gouttelettes en vrac, il est important de suivre exactement le moment pendant la pré-incubation des APC et le réamaigrissement tel que décrit dans ce protocole.
Après avoir réchauré les gouttelettes d’hépatocyte vitrifié, vous vous retrouverez avec une meilleure suspension de dimensionnement qui peut donc être utilisé de la même manière que si elles étaient fraîchement isolées. Comme méthode améliorée de conservation, la vitrification de gouttelette en vrac peut augmenter la disponibilité pri-ma pour la recherche et les applications cliniques.
