البروتوكول يسمح تقدير الطفرات في الميكروبات. ويمكن أن تبين كيف الكائنات الحية السياق البيئي آثار احتمال الطفرة التلقائية. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه رخيص وفعال.
ويمكن إجراء العديد من التقديرات لمعدل الطفرات بالتوازي. الطفرات التي يمكن أن تتبع هذه التدابير البروتوكول مقاومة للمضادات الحيوية. لذلك يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة واحدة من أكبر التحديات في العالم، ومقاومة مضادات الميكروبات.
ويمكن لهذه الطريقة أن توفر نظرة ثاقبة على كيفية تأثير السياق الإيكولوجي للخلايا على تطور مقاومة مضادات الميكروبات. هذا البروتوكول يقدر معدلات الطفرات في الزراعة الأحادية من سلالة المختبرات، ولكننا طبقت على السلالات السريرية والثقافة المشتركة من سلالات اثنين للتمييز بين جزيء بيونيوترال. أكثر التفاعلات خطورة المستخدمة في هذا البروتوكول هي ريفامبيسين والمضادات الحيوية والميثانول.
لذا تأكد من استخدام القفازات الواقية والنظارات الواقية عندما يذوب ريفامبيسين في الميثانول. لبدء هذا الإجراء تطعيم ثلاثة مل من مرق ليسوجيني السائل مع كشط من الجليد من مخزون الغليسير K12 E.coli. هز ثقافة LB عند 120 دورة في الدقيقة وعند 37 درجة مئوية لمدة سبع ساعات تقريبًا.
بعد ذلك، تمييع الثقافة 2000-fold مع المحلول الملحي. إضافة 10 مل من السائل ديفيس الحد الأدنى المتوسطة لكل أنبوب مع كل يحتوي على تركيز مختلف من الجلوكوز كما هو مبين هنا. إضافة 100 ميكرولترات من ثقافة مخففة إلى ثلاثة 50 مل غطاء الشاشة المخروطية أنابيب البوليمر القاع.
إعداد 22 مل من خمسة حلول مختلفة من السائل ديفيس الحد الأدنى من المتوسطة مع الجلوكوز, كل في أنبوب 50 مل الخاصة بها كما الخطوط العريضة في بروتوكول النص. لإعداد inocula للبيئات، وقياس أولا الكثافة البصرية من الثقافات بين عشية وضحاها في 600 نانومتر. تمييع الثقافات مع محلول ملحي وإضافة بين 2200 و 110000 الخلايا إلى كل بيئة.
وهذا يضمن أن inoculum لmL واحد من البيئة يحتوي على ما بين 1000 و 5000 الخلايا. المقبل، إنشاء تخطيط عشوائي من الثقافات الموازية ل 196 لوحة جيدا عميق. نقل مل واحد من وسائل الإعلام تلقيح في كل بئر من لوحة وفقا للتخطيط.
ثم، إصلاح غطاء لوحة مع الشريط ووزنها لوحة كاملة مع الغطاء والشريط. هز اللوحة عند 250 دورة في الدقيقة وعند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، ضع اثنين من L من الماء المقطر في الحاضنة لتثبيت كمية التبخر بين المجموعات التجريبية.
تحديد حجم inoculum عن طريق طلاء 10 ميكرولترات من كل من وسائل الإعلام تلقيح على لوحة Agar TA غير انتقائية. استخدم مُعمّمًا على شكل حرف L حتى يجف سطح agar. ثم, إعداد انتقائية TA أجار تحتوي على ريفامبيسين في ستة لوحات جيدا.
ماشيت خمسة مل من Agar TA انتقائية في كل بئر من لوحات الآبار الستة. عد وحدات تشكيل مستعمرة على لوحات أجار غير انتقائية، وتحديد حجم inocula. بعد 24 ساعة من الحضانة، وزن لوحة بئر عميق كامل لتحديد كمية التبخر، والتي من المرجح أن حوالي 10٪ نقل ثلاث الثقافات المختارة عشوائيا لكل مقايسة في أنابيب microcentcentuge المسمى.
لوحة الثقافات الموازية المتبقية 81 من لوحة بئر عميق على agar TA انتقائية تحتوي على ريفامبيسين. بعد ذلك ، قم بإزالة الأغطية من لوحات agar الانتقائية وتركها مكشوفة في ظروف معقمة لتجفيف كل السائل على سطح agar. تحديد عدد وحدات تشكيل مستعمرة عن طريق تمييع الثقافات من أنابيب microcentrifuge باستخدام خمس خطوات تخفيف 10 أضعاف عن طريق خلط ودوامة 900 ميكرولترات من محلول ملحي مع 100 ميكرولترات من ثقافة كل خطوة التخفيف.
لوحة 40 ميكروليترات من التخفيف النهائي على agar TA غير انتقائية ووضع الغطاء على لوحات. احتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية. مرة واحدة كل من الآبار على لوحة ستة بئر خالية من السائل الثقافة، ووضع الغطاء مرة أخرى على.
ثم احتضان لوحات مع غطاء على 37 درجة مئوية لمدة 44-48 ساعة. في اليوم الرابع، عد وحدات تشكيل المستعمرة على لوحات أجار غير انتقائية. في اليوم الخامس، عد عدد المستعمرات التي تقاوم المضادات الحيوية على لوحات TA agar الانتقائية.
تسجيل التوزيع بين الثقافات المتوازية لعدد من المسوخ المرصودة لمحسب معين. افتح البرنامج المناسب على الكمبيوتر. في علامة التبويب اختبار الفرضية، اترك القيم في الإعدادات الافتراضية الخاصة بها.
انقر فوق استعراض وحدد الملف النصي مع توزيع المسوخ الملاحظة. بعد تحميل الملف، انقر على اختبار مُنجز. على الجانب الأيمن، تحت نتيجة الاختبار، تحت عينة واحدة ML اختبار، العثور على عدد طفرة.
هذا هو m، العدد المتوقع من الأحداث الطفرة. ثم، تقدير معدل الطفرة من نوع وراثي معين في بيئة معينة كما هو مخطط في بروتوكول النص. يتم عرض معدلات الطفرات MG1655 من ثلاث علامات مختلفة فينوكيبيك، السيكلوسيرين، ريفامبيسين، وحمض ناليديكسيك هنا.
يتم تقييم معدلات الطفرات في وسط ديفيس الحد الأدنى مع تركيز الجلوكوز 80 ملغ / لتر ، 125 ملغ / لتر ، و 250 ملغ / لتر. في حالة واحدة، يتم استخدام تركيز الجلوكوز من 1000 ملغ / لتر. كما هو متوقع، معدلات الطفرات هي أعلى لمقاومة السيكلوسيرين، أدنى لمقاومة حمض نافيديكسيك، ومعدل مقاومة ريفامبيسين هو في الوسط.
ويبين التذبذب بوضوح أي سلالة هي متحولة تأسيسية ولديها معدلات طفرات طبيعية. كما كان سلالة حذف mutT معدل طفرة إلى nalidixic حمض المقاومة التي هي ما يقرب من 50x أعلى من السيطرة MG1655 سلالة. أثناء إجراء هذا البروتوكول، تأكد من نمو الخلايا بشكل جيد.
وينبغي أن تنمو إلى كثافة موحدة عبر الثقافات الموازية مع نفس البيئة. إحدى المتابعات لهذا الإجراء هي تحديد تسلسل الحمض النووي للجين rpoB في المستعمرات المقاومة. لتحديد كيفية اختلاف طيف الطفرات إلى مقاومة الريفامبيسين مع النمط الجيني الميكروبي البيئي.
أظهرت التقلبات في القرن العشرين كيف أن الطفرة عفوية وعشوائية مع احترام البيئة. الآن، إنهم يُسفكون ضوءاً جديداً على كيف تختلف معدلات الطفرات مع البيئة وراثياً، إيكولوجياً، حتى اجتماعياً.
