Protokol mikroplarda mutasyon tahmini sağlar. Bir organizmanın çevresel bağlamının spontan mutasyon olasılığını nasıl etkilediğini gösterebilir. Bu protokolün en büyük avantajı ucuz ve verimli olmasıdır.
Mutasyon oranı birçok tahmin paralel olarak yapılabilir. Bu protokolde ölçtünmülebilen mutasyonlar antibiyotiklere karşı direnç olabilir. Yani bu protokol dünyanın en büyük sorunlarından biri olan antimikrobiyal direnci incelemek için kullanılabilir.
Bu yöntem, hücrelerin ekolojik bağlamının antimikrobiyal direncin evrimini nasıl etkiedebileceğine dair içgörü sağlayabilir. Bu protokol laboratuvar suşumonokültüründe mutasyonoranlarını tahmin ediyor, ama biz bunu biyonötr molekülü ayırt etmek için iki suşun klinik suşlarına ve ortak kültürüne uyguladık. Bu protokolde kullanılan en tehlikeli reaksiyonlar antibiyotik rifampisin ve metanoldür.
Bu yüzden rifampisin metanol içinde çözülür zaman koruyucu eldiven ve gözlük kullandığınızdan emin olun. Bu işlem başlamak için E.coli K12 gliserol stok buz bir sıyrık ile sıvı lysogeny suyu üç mL aşılamak. Yaklaşık yedi saat boyunca 120 rpm ve 37 santigrat derecede LB kültürünü çalkalayın.
Bundan sonra, tuzlu çözelti ile kültürü 2000 kat seyreltin. Burada gösterildiği gibi her biri farklı bir glikoz konsantrasyonu içeren her tüpe 10 mL sıvı Davis minimal orta ekleyin. Üç 50 mL ekran kapağı konik alt polimer tüpler için seyreltilmiş kültür 100 mikrolitre ekleyin.
Metin protokolünde anahat olarak her biri kendi 50 mL tüpünde bulunan glikozlu sıvı Davis minimal ortamının beş farklı çözeltisinin 22 mL'sini hazırlayın. Ortamlar için inocula hazırlamak için, ilk 600 nanometre gecede kültürlerin optik yoğunluğunu ölçmek. Tuz çözeltisi ile kültürleri seyreltin ve her ortama 2200 ve 110000 hücreleri ekleyin.
Bu, ortamın bir mL'sinin inoculumunun 1000 ile 5000 arasında hücre içermesini sağlayacaktır. Sonra, 196 derin kuyu plaka için paralel kültürlerin rasgele bir düzen oluşturun. Aşılanmış ortamın bir mL'sini, düzene göre plakanın her kuyuya aktarın.
Daha sonra, bant ile plaka kapağını düzeltmek ve kapak ve bant ile tüm plaka tartmak. 250 rpm ve 24 saat boyunca 37 derece santigrat plaka sallayın. Bundan sonra, deney setleri arasında buharlaşma miktarını stabilize etmek için kuvözde iki L distile su yerleştirin.
Non-selektif BIR TA agar plaka üzerinde aşılanmış ortam her 10 mikrolitre kaplama ile inoculum boyutunu belirleyin. Agar yüzeyi kuruyana kadar steril L şeklinde bir yayıcı kullanın. Daha sonra, altı kuyu plakaları rifampisin içeren seçici TA agar hazırlayın.
Pipet altı kuyu plakaları her kuyu içine seçici TA agar beş mL. Seçici olmayan agar plakaları üzerinde koloni oluşturan birimleri saymak ve boyutu inocula belirlemek. Kuluçka 24 saat sonra, buharlaşma miktarını belirlemek için tüm derin kuyu plaka tartmak, hangi civarında muhtemeldir 10%Transfer üç rasgele seçilmiş kültürler etiketli mikrosantrifüj tüpler içine tsay başına.
Kalan 81 paralel kültürü derin kuyu plakasından rifampisin içeren seçici TA agar'a koyun. Daha sonra, seçici agar plakaları kapakları çıkarın ve agar yüzeyinde sıvı tüm kuruması için steril koşullarda açık bırakın. 900 mikrolitre tuzlu çözeltiyi seyreltme adımı başına 100 mikrolitre ile karıştırıp girdaplayarak, 10 kat seyreltme adımlarını kullanarak mikrosentrifüge tüplerinden kültürleri seyrelterek koloni oluşturan birimlerin sayısını belirleyin.
Plaka 40 mikrolitre son seyreltme non-selektif TA agar ve plakalar üzerinde kapak yerleştirin. Bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yat. Altı kuyu plakası üzerindeki tüm kuyular kültür sıvısı içermez, kapağı tekrar kapatın.
Daha sonra 44-48 saat boyunca 37 santigrat derece kapağı ile plakalar inkübed. Dördüncü günde, seçici olmayan agar plakaları üzerinde koloni oluşturan birimleri say. Beşinci gün, seçici TA agar plakaları üzerinde antibiyotik dirençli kolonilerin sayısını saymak.
Belirli bir tsay için mutantların gözlenen sayısıparalel kültürler arasında dağılımı kaydedin. Bilgisayarda uygun yazılımı açın. Hipotez sınama sekmesinde, değerleri varsayılan değerlerinde bırakın.
Göz atın ve gözlenen mutantların dağılımı ile metin dosyası seçin. Dosyayı yükledikten sonra yapılan teste tıklayın. Sağ tarafta, test sonucu altında, One Sample ML-testi altında, mutasyon numarasını bulun.
Bu m, beklenen mutasyonel olaylar sayısı. Daha sonra, metin protokolünde anahat olarak belirli bir ortamda belirli bir genotip mutasyon oranını tahmin edin. Mg1655 üç farklı fenotipik belirteç, sikloserin, rifampisin ve nalidixic asit mutasyon oranları burada gösterilmiştir.
Mutasyon oranları Davis minimal ortamda 80 mg/L, 125 mg/L ve 250 mg/L glukoz konsantrasyonu ile değerlendirilir. Bir durumda 1000 mg/L glikoz konsantrasyonu kullanılır. Beklendiği gibi, mutasyon oranları sikloserin direnci için daha yüksek, nalidixic asit direnci için en düşük, ve rifampisin direnci oranı ortada.
Dalgalanma töz, hangi suşun kurucu bir mutasyon olduğunu ve normal mutasyon oranlarına sahip olduğunu açıkça göstermektedir. MutT deletant suşu nalidixic asit direncine mutasyon oranı olduğu için kontrol MG1655 suşundan yaklaşık 50 kat daha yüksektir. Bu protokolü önceden bilgilendirirken, hücrelerinizin iyi büyüdüğünden emin olun.
Aynı çevreye sahip paralel kültürler arasında tek tip yoğunlukta büyümeleri gerekir. Bu işlemin takiplerinden biri dirençli kolonilerde rpoB geninin DNA dizilimini belirlemektir. Rifampisin direncine mutasyon spektrumunun çevresel mikrobiyal genotip ile nasıl değiştiğini belirlemek için.
20. yüzyıldaki dalgalanma lar mutasyonun çevreye göre nasıl spontane ve rastgele olduğunu göstermiştir. Mutasyon oranlarının çevreye genetik, ekolojik, hatta sosyal olarak nasıl değiştiğine ışık talıyor.
