Das Protokoll ermöglicht die Mutationsabschätzung in Mikroben. Es kann zeigen, wie ein Organismen Umweltkontext die Wahrscheinlichkeit einer spontanen Mutation beeinflusst. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist, dass es billig und effizient ist.
Viele Schätzungen der Mutationsrate können parallel vorgenommen werden. Mutationen, die dieses Protokoll misst, könnten der Resistenz gegen Antibiotika folgen. Dieses Protokoll kann also verwendet werden, um eine der weltweit größten Herausforderungen zu untersuchen, die Antibiotikaresistenz.
Diese Methode kann einen Einblick in die Auswirkungen des ökologischen Kontexts von Zellen auf die Entwicklung der antibiotika-resistenz geben. Dieses Protokoll schätzt die Mutationsraten in der Monokultur von Laborstämmen, aber wir haben sie auf klinische Stämme und Kokultur von zwei Stämmen angewendet, um bioneutrale Moleküle zu unterscheiden. Die gefährlichsten Reaktionen in diesem Protokoll sind Antibiotikum Rifampicin und Methanol.
So achten Sie darauf, Schutzhandschuhe und Schutzbrillen zu verwenden, wenn Rifampicin in Methanol gelöst wird. Um dieses Verfahren zu beginnen, impfen Sie drei ml flüssige Lysogenybrühe mit einem Eiskratzer aus dem E.coli K12 Glycerinbestand. Schütteln Sie die LB-Kultur bei 120 Umdrehungen pro Minute und bei 37 Grad Celsius für etwa sieben Stunden.
Danach die Kultur 2000-fach mit der Saline-Lösung verdünnen. Fügen Sie 10 ml flüssiges Davis-Minimalmedium zu jeder Röhre hinzu, wobei jede eine andere Glukosekonzentration enthält, wie hier gezeigt. Fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Kultur zu drei 50 ml Siebkappe konische Bodenpolymerrohre.
Bereiten Sie 22 ml von fünf verschiedenen Lösungen von flüssigen Davis minimal Medium mit Glukose, jede in seinem eigenen 50 ml Rohr als Umriss im Textprotokoll. Um Eine Impfung für die Umgebungen vorzubereiten, messen Sie zunächst die optische Dichte der Nachtkulturen mit 600 Nanometern. Verdünnen Sie die Kulturen mit einer Salinelösung und fügen Sie jede Umgebung zwischen 2200 und 110000 Zellen hinzu.
Dadurch wird sichergestellt, dass das Inokulum für einen ml der Umgebung zwischen 1000 und 5000 Zellen enthält. Als nächstes erstellen Sie ein zufälliges Layout von parallelen Kulturen für 196 tiefe Brunnenplatte. Übertragen Sie je nach Layout einen ml der geimpften Medien in jeden Brunnen der Platte.
Dann befestigen Sie den Deckel der Platte mit Klebeband und wiegen Sie die gesamte Platte mit dem Deckel und Band. Schütteln Sie die Platte bei 250 Umdrehungen pro Minute und bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Danach zwei L destilliertes Wasser in den Inkubator geben, um die Verdunstungsmenge unter den Versuchssätzen zu stabilisieren.
Bestimmen Sie die Inokulumgröße, indem Sie 10 Mikroliter jedes der geimpften Medien auf einer nicht selektiven TA-Agarplatte verschichten. Verwenden Sie einen sterilen L-förmigen Streuer, bis die Agaroberfläche trocken ist. Dann bereiten Sie selektiven TA-Agar mit Rifampicin in sechs Brunnenplatten zu.
Pipette fünf ml des selektiven TA-Agars in jeden Brunnen der sechs Brunnenplatten. Zählen Sie die Kolonie bildenden Einheiten auf den nicht-selektiven Agarplatten und bestimmen Sie die Größe der Inocula. Nach 24 Stunden Inkubation wiegen Sie die gesamte Tiefbrunnenplatte, um die Verdunstungsmenge zu bestimmen, die wahrscheinlich um 10% beträgt, übertragen Sie drei zufällig ausgewählte Kulturen pro Assay in markierte Mikrozentrifugenröhren.
Die restlichen 81 Parallelkulturen aus der tiefen Brunnenplatte auf den selektiven TA-Agar mit Rifampicin geben. Als nächstes entfernen Sie die Deckel von den selektiven Agarplatten und lassen Sie sie unter sterilen Bedingungen frei, um die gesamte Flüssigkeit auf der Oberfläche des Agars auszutrocknen. Bestimmen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten, indem Sie die Kulturen aus den Mikrozentrifugenrohren mit fünf 10-fachen Verdünnungsschritten verdünnen, indem Sie 900 Mikroliter Kochchen Kochchen Lösung mit 100 Mikroliter der Kultur pro Verdünnungsschritt mischen und wirbeln.
Platte 40 Mikroliter der endigen Verdünnung auf den nicht-selektiven TA-Agar und legen Sie den Deckel auf die Platten. Über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sobald alle Brunnen auf einer sechs Brunnenplatte frei von der Kulturflüssigkeit sind, legen Sie den Deckel wieder auf.
Dann die Platten mit dem Deckel auf 37 Grad Celsius für 44-48 Stunden inkubieren. Zählen Sie am vierten Tag die Koloniebildenden Einheiten auf den nicht-selektiven Agarplatten. Zählen Sie am fünften Tag die Anzahl der Kolonien, die gegen das Antibiotikum resistent sind, auf den selektiven TA-Agarplatten.
Erfassen Sie die Verteilung der beobachteten Anzahl von Mutanten für einen bestimmten Test zwischen parallelen Kulturen. Öffnen Sie die entsprechende Software auf dem Computer. Belassen Sie auf der Registerkarte Hypothesentests die Werte bei ihren Standardwerten.
Klicken Sie auf Durchsuchen und markieren Sie die Textdatei mit der Verteilung der beobachteten Mutanten. Nachdem Sie die Datei hochgeladen haben, klicken Sie auf "Durchgeführter Test". Auf der rechten Seite, unter dem Ergebnis des Tests, unter dem One Sample ML-Test, finden Sie die Mutationszahl.
Dies ist m, die erwartete Anzahl von Mutationsereignissen. Schätzen Sie dann die Mutationsrate eines bestimmten Genotyps in einer bestimmten Umgebung als Gliederung im Textprotokoll. Die MG1655-Mutationsraten von drei verschiedenen phänotypischen Markern, Cycloserin, Rifampicin und Nalidixsäure, sind hier dargestellt.
Mutationsraten werden in Davis minimalen Medium mit Glukosekonzentration von 80 mg/L, 125 mg/L und 250 mg/L bewertet. In einem Fall wird eine Glukosekonzentration von 1000 mg/L verwendet. Wie erwartet, sind die Mutationsraten für die Cycloserinresistenz höher, die niedrigste für die Nalidixsäureresistenz, und die Rate der Rifampicin-Resistenz liegt in der Mitte.
Der Fluktuationstest zeigt deutlich, welcher Stamm ein konstitutiver Mutator ist und welcher normale Mutationsraten hat. Da der mutT-Deletantstamm eine Mutationsrate bis zur Nalidixsäureresistenz hatte, die etwa 50-fach höher ist als der Kontrollstamm MG1655. Stellen Sie beim Vorformen dieses Protokolls sicher, dass Ihre Zellen gut wachsen.
Sie sollten zu einer gleichmäßigen Dichte zwischen parallelen Kulturen mit der gleichen Umgebung anwachsen. Ein Follow-up zu diesem Verfahren ist die Bestimmung der DNA-Sequenz des rpoB-Gens in resistenten Kolonien. Um zu bestimmen, wie das Spektrum der Mutationen zu Rifampicin Resistenz variiert mit Umwelt mikrobiellen Genotyp.
Fluktuationstests im 20. Jahrhundert zeigten, wie spontan und zufällig Mutationen in Bezug auf die Umwelt sind. Jetzt werfen sie ein neues Licht darauf, wie die Mutationsraten genetisch, ökologisch, sogar sozial mit der Umwelt variieren.
