O protocolo permite a estimativa mutacional em micróbios. Pode demonstrar como um contexto ambiental de organismos afeta a probabilidade de mutação espontânea. A principal vantagem deste protocolo é que ele é barato e eficiente.
Muitas estimativas de taxa de mutação podem ser feitas em paralelo. Mutações que este protocolo mede poderiam seguir resistência a antibióticos. Então este protocolo pode ser usado para estudar um dos maiores desafios do mundo, a resistência antimicrobiana.
Este método pode fornecer uma visão de como o contexto ecológico das células pode afetar a evolução da resistência antimicrobiana. Este protocolo estima taxas mutacionais na monocultura da cepa laboratorial, mas a aplicamos a cepas clínicas e co-cultura de duas cepas para distinguir moléculas bioneutais. As reações mais perigosas usadas neste protocolo são a rifampicina antibiótico e o metanol.
Por isso, certifique-se de usar luvas de proteção e óculos quando a rifampicina for dissolvida em metanol. Para iniciar este procedimento inocular três mL de caldo líquido de liseogenia com um arranhão de gelo do estoque de Glicerol E.coli K12. Agite a cultura LB a 120 rpm e a 37 graus celsius por aproximadamente sete horas.
Depois disso, diluir a cultura 2000 vezes com a solução salina. Adicione 10 mL de líquido Davis médio mínimo a cada tubo com cada um contendo uma concentração diferente de glicose como mostrado aqui. Adicione 100 microliters da cultura diluída a três tubos de polímeros de fundo cônicos de tampa de tela de 50 mL.
Prepare 22 mL de cinco soluções diferentes de médio mínimo líquido Davis com glicose, cada uma em seu próprio tubo de 50 mL como contorno no protocolo de texto. Para preparar inocula para os ambientes, primeiro meça a densidade óptica das culturas noturnas em 600 nanômetros. Diluir as culturas com solução salina e adicionar entre 2200 e 110000 células a cada ambiente.
Isso garantirá que o inóculo para um mL do ambiente contenha entre 1000 e 5000 células. Em seguida, crie um layout aleatório de culturas paralelas para 196 placa de poço profundo. Transfira um mL da mídia inoculada em cada poço da placa de acordo com o layout.
Em seguida, conserte a tampa da placa com fita adesiva e pese toda a placa com a tampa e a fita. Agite a placa a 250 rpm e a 37 graus Celsius por 24 horas. Depois disso, coloque dois L de água destilada na incubadora para estabilizar a quantidade de evaporação entre os conjuntos experimentais.
Determine o tamanho do inóculo, emplacando 10 microliters de cada uma das mídias inoculadas em uma placa de ágar TA não-seletiva. Use um espalhador em forma de L estéril até que a superfície do ágar esteja seca. Em seguida, prepare o ágar TA seletivo contendo rifampicina em seis placas de poço.
Pipeta cinco mL do ágar TA seletivo em cada poço das seis placas do poço. Conte as unidades de formação da colônia nas placas de ágar não-seletivas, e determine o tamanho da inocula. Após 24 horas de incubação, pese toda a placa de poço profundo para determinar a quantidade de evaporação, que é provavelmente em torno de 10% Transfira três culturas escolhidas aleatoriamente por ensaio em tubos de microcentrifuuge rotulados.
Emplaque as 81 culturas paralelas restantes da placa do poço profundo para o ágar TA seletivo contendo rifampicina. Em seguida, remova as tampas das placas de ágar seletivas e deixe-as descobertas em condições estéreis para secar todo o líquido na superfície do ágar. Determine o número de unidades formadoras de colônias diluindo as culturas dos tubos de microcentrifuus usando cinco passos de diluição de 10 vezes misturando e vórtice 900 microliters de solução salina com 100 microliters da cultura por etapa de diluição.
Placa 40 microliters da diluição final no ágar TA não seletivo e coloque a tampa sobre as placas. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius. Uma vez que todos os poços em uma placa de seis poços estão livres do líquido da cultura, coloque a tampa novamente.
Em seguida, incubar as placas com a tampa ligada a 37 graus Celsius por 44-48 horas. No quarto dia, conte a colônia formando unidades nas placas de ágar não-seletivas. No quinto dia, conte o número de colônias resistentes ao antibiótico nas placas seletivas de ágar TA.
Registo a distribuição entre culturas paralelas do número observado de mutantes para um determinado ensaio. Abra o software apropriado no computador. Na guia de teste de hipóteses, deixe os valores à sua disposição.
Clique em procurar e selecione o arquivo de texto com a distribuição de mutantes observados. Depois de carregar o arquivo, clique no teste realizado. No lado direito, sob o resultado do teste, sob o teste de ML de uma amostra, encontre o número de mutação.
Este é o número esperado de eventos mutacionais. Em seguida, estime a taxa de mutação de determinado genótipo em um ambiente específico como esboço no protocolo de texto. As taxas de mutação MG1655 de três marcadores fenotípicos diferentes, cicloserina, rifampicina e ácido nalidílico são mostradas aqui.
As taxas de mutação são avaliadas em davis médio mínimo com concentração de glicose de 80 mg/L, 125 mg/L e 250 mg/L. Em um caso, é utilizada uma concentração de glicose de 1000 mg/L. Como esperado, as taxas de mutação são mais altas para resistência à cicloserina, mais baixa para resistência ao ácido nalidílico, e a taxa de resistência à rifampicina está no meio.
O ensaio de flutuação mostra claramente qual cepa é um mutador constitutivo e que tem taxas normais de mutação. Como a cepa deletante mutT tinha uma taxa de mutação para resistência ao ácido nalidúlico que é aproximadamente 50x maior do que a cepa MG1655 de controle. Enquanto pré-formam este protocolo, certifique-se de que suas células estão crescendo bem.
Eles devem estar crescendo a densidade uniforme entre culturas paralelas com o mesmo ambiente. Um acompanhamento deste procedimento é determinar a sequência de DNA do gene rpoB em colônias resistentes. Para determinar como o espectro de mutações à resistência à rifampicina varia com o genótipo microbiano ambiental.
Ensaios de flutuação no século XX demonstraram como a mutação é espontânea e aleatória em relação ao meio ambiente. Agora, eles estão lançando uma nova luz sobre como as taxas de mutação variam com o ambiente geneticamente, ecologicamente, até mesmo socialmente.
