Il protocollo consente una stima mutazionale nei microbi. Può dimostrare come un contesto ambientale degli organismi effetti la probabilità di mutazione spontanea. Il vantaggio principale di questo protocollo è che è economico ed efficiente.
Molte stime del tasso di mutazione possono essere fatte in parallelo. Mutazioni che questo protocollo misura potrebbe seguire la resistenza agli antibiotici. Quindi questo protocollo può essere usato per studiare una delle più grandi sfide del mondo, la resistenza antimicrobica.
Questo metodo può fornire informazioni su come il contesto ecologico delle cellule può effettuare l'evoluzione della resistenza antimicrobica. Questo protocollo stima i tassi mutazionali nella monocoltura del ceppo di laboratorio, ma lo abbiamo applicato a ceppi clinici e co-coltura di due ceppi per distinguere la molecola bioneutrale. Le reazioni più pericolose utilizzate in questo protocollo sono la rifampicina antibiotica e il metanolo.
Quindi assicurati di usare guanti protettivi e occhiali quando la rifampicina viene sciolta in metanolo. Per iniziare questa procedura inoculare tre mL di brodo di lisogenia liquida con una raschiatura di ghiaccio dallo stock di glicerolo E.coli K12. Scuotere la cultura LB a 120 giri/min e a 37 gradi celsius per circa sette ore.
Successivamente, diluire la coltura 2000-fold con la soluzione salina. Aggiungere 10 ml di mezzo minimo Davis liquido ad ogni tubo con ciascuno contenente una diversa concentrazione di glucosio, come mostrato qui. Aggiungere 100 microlitri della coltura diluita a tre tubi polimerici inferiori conici con cappuccio a schermo da 50 ml.
Preparare 22 ml di cinque diverse soluzioni di mezzo minimo Davis liquido con glucosio, ognuna nel proprio tubo da 50 ml come contorno nel protocollo di testo. Per preparare l'inoculo per gli ambienti, misurare prima la densità ottica delle colture notturne a 600 nanometri. Diluire le colture con soluzione salina e aggiungere tra 2200 e 110000 cellule ad ogni ambiente.
Ciò garantirà che l'inoculo per un mL dell'ambiente contenga tra 1000 e 5000 cellule. Successivamente, creare un layout casuale di colture parallele per 196 piastre di pozzo profondo. Trasferire un mL del supporto inoculato in ogni pozzo della piastra in base al layout.
Quindi, fissare il coperchio della piastra con nastro adesivo e pesare l'intera piastra con il coperchio e il nastro adesivo. Agitare il piatto a 250 giri/min e a 37 gradi Celsius per 24 ore. Successivamente, posizionare due L di acqua distillata nell'incubatore per stabilizzare la quantità di evaporazione tra gli insiemi sperimentali.
Determinare la dimensione dell'inoculo placcando 10 microlitri di ciascuno dei mezzi inoculati su una piastra di agar TA non selettiva. Utilizzare uno spargitore sterile a forma di L fino a quando la superficie dell'agar è asciutta. Quindi, preparare un agar TA selettivo contenente rifampicina in sei piastre di pozzo.
Pipetta cinque mL dell'agar TA selettivo in ogni pozzo delle sei piastre del pozzo. Contare le unità di formazione della colonia sulle placche di agar non selettive e determinare le dimensioni dell'inoculo. Dopo 24 ore di incubazione, pesare l'intera piastra del pozzo profondo per determinare la quantità di evaporazione, che è probabilmente intorno al 10%Trasferire tre colture scelte casualmente per saggio in tubi di microcentrifugo etichettati.
Placcare le restanti 81 colture parallele dalla piastra del pozzo profondo sull'agar TA selettivo contenente rifampicina. Quindi, rimuovere i coperchi dalle piastre di agar selettive e lasciarli scoperti in condizioni sterili per asciugare tutto il liquido sulla superficie dell'agar. Determinare il numero di unità di formazione della colonia diluendo le colture dai tubi di microcentrifugo utilizzando cinque fasi di diluizione di 10 volte mescolando e vortexando 900 microlitri di soluzione salina con 100 microlitri della coltura per fase di diluizione.
Piastra 40 microlitri della diluizione finale sull'agar TA non selettivo e posizionare il coperchio sulle piastre. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Una volta che tutti i pozzi su un piatto di sei pozzali sono privi del liquido di coltura, riposizionare il coperchio.
Quindi incubare le piastre con il coperchio a 37 gradi Celsius per 44-48 ore. Il quarto giorno, conta le unità di formazione della colonia sulle placche di agar non selettive. Il quinto giorno, conta il numero di colonie resistenti all'antibiotico sulle piastre di agar TA selettive.
Registrare la distribuzione tra le colture parallele del numero osservato di mutanti per un particolare saggio. Aprire il software appropriato sul computer. Nella scheda test ipotesi lasciare i valori alle impostazioni predefinite.
Fare clic su sfoglia e selezionare il file di testo con la distribuzione dei mutanti osservati. Dopo aver caricato il file, fare clic sul test eseguito. Sul lato destro, sotto il risultato del test, sotto il test One Sample ML, trovare il numero di mutazione.
Questo è m, il numero previsto di eventi mutazionali. Quindi, stimare il tasso di mutazione di particolare genotipo in un particolare ambiente come struttura nel protocollo di testo. Qui sono riportati i tassi di mutazione MG1655 di tre diversi marcatori fenotipici, cicloerina, rifampicina e acido nalidixico.
I tassi di mutazione sono valutati nel mezzo minimo Davis con concentrazione di glucosio di 80 mg/L, 125 mg/L e 250 mg/L. In un caso viene utilizzata una concentrazione di glucosio di 1000 mg/L. Come previsto, i tassi di mutazione sono più alti per la resistenza alla ciclocierina, più bassi per la resistenza all'acido nalidixico e il tasso di resistenza alla rifampicina è nel mezzo.
Il saggio di fluttuazione mostra chiaramente quale ceppo è un mutatore costitutivo e quali ha tassi di mutazione normali. Poiché il ceppo deletante mutT aveva un tasso di mutazione alla resistenza all'acido nalidixico che è circa 50 volte superiore al ceppo MG1655 di controllo. Durante la preformatura di questo protocollo, assicurarsi che le celle siano in crescita bene.
Dovrebbero crescere fino a raggiungere una densità uniforme tra culture parallele con lo stesso ambiente. Un seguito di questa procedura è determinare la sequenza di DNA del gene rpoB in colonie resistenti. Per determinare come lo spettro delle mutazioni alla resistenza alla rifampicina varia con il genotipo microbico ambientale.
I test di fluttuazione nel 20 ° secolo hanno dimostrato come la mutazione sia spontanea e casuale con rispetto per l'ambiente. Ora, stanno gettando nuova luce su come i tassi di mutazione variano con l'ambiente geneticamente, ecologicamente, anche socialmente.
