El establecimiento de protocolos de transfección para las especies de Eimeria ayudaría a avanzar en el estudio de las funciones genéticas, el desarrollo de nuevas vacunas y la detección de nuevas dianas farmacológicas para Eimeria. Utilizando esta técnica, logramos la transfección de varias especies de Eimeria, y la nucleofección es una herramienta útil para facilitar la aplicación de la manipulación genética en parásitos eimerios. La nucleofección de Eimeria proporciona una referencia para la transfección de otros parásitos que no se pueden cultivar in vitro y acelerarán el estudio de su manipulación genética.
Si prueba esta técnica por primera vez, debe preparar bien todos los reactivos y sus instrumentos antes del inicio de la transfección para evitar la revuelta durante el experimento. La realización de este método ayuda a las personas que se centran en la transfección de Eimeria a ver los detalles intrincados de este experimento. Para comenzar con la liberación de esporocitos, centrifugar una vez 10 a los siete ovocitos esporulados en solución de dicromato potáreo a 2.300 veces g durante cinco minutos.
Lávelos con PBS tres veces. Resuspender el pellet con un mililitro de PBS, y transferir la mezcla a un tubo de 15 mililitros. Añade un volumen igual de perlas de vidrio de un milímetro de diámetro, y oscila la suspensión del ovocitos usando un mezclador de vórtice para liberar los esporocitos.
Cada minuto, monitoree la liberación de esporocitos por microscopía. Cuando más del 90% de los ovocitos están rotos, deje de vórtice. Transfiera la suspensión del esporocitos a nuevos tubos de 1,5 mililitros y centrifuga a 1.600 veces g durante cinco minutos.
Resuspender el precipitado con un mililitro de 50% de solución de gradiente de densidad, y centrífuga a 10.000 g durante un minuto. Para liberar esporozoitos, resuspender el precipitado con tampón de excystation, e incubar en un baño de agua Celsius de 42 grados durante 40 a 60 minutos para liberar los esporozoitos. Agitar los tubos una vez cada cinco minutos durante la excisancia.
Cuando se libere más del 90% de los esporozoitos, deje de incubar. Centrifugar a 600 veces g durante 10 minutos. Resuspender la precipitación con un mililitro de 55% de solución de gradiente de densidad, y centrifugar el tubo a 10.000 g durante un minuto.
Resuspender la precipitación con un mililitro de PBS, y contar los esporozoitos usando un hemocicómetro. Para recoger las merozoitas de segunda generación de Eimeria necatrix, corte el intestino de pollo longitudinalmente del tallo de la yema al orificio ileocécal, y lávelo con PBS o HBSS suavemente tres veces en un plato de Petri. Cortar el intestino en pedazos, y colocarlos en un matraz cónico con un tampón de digestión.
Coloque el matraz en un mezclador magnético a 37 grados Celsius con una barra de agitación durante 30 a 60 minutos para liberar merozoítos. Después de 30 minutos de incubación, monitoree la liberación de merozoítos mediante examen microscópico cada cinco minutos. Para purificar los merozoítos, verter la suspensión que contiene merozoítos digeridos sobre cuatro capas de gasa para filtrar en tubos de 50 mililitros, y centrifugar los tubos a 600 veces g durante 10 minutos.
Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante que contiene restos intestinales. Transfiera la precipitación con merozoítos purificados a tubos de 1,5 mililitros. Resuspender la precipitación con un mililitro de PBS, y contar los merozoítos usando un hemocicómetro.
En primer lugar, centrifugar la suspensión de esporozoito o merozoita a 600 veces g durante 10 minutos. A continuación, deseche el sobrenadante. En el siguiente orden, añada 85 microlitros de tampón de transfección nuclear, 10 microgramos de plásmido y 25 unidades de enzima de restricción en el tubo de 1,5 mililitros que contiene esporozoitos o merozoites.
Transfiera la suspensión a una taza de transfección nuclear. Ponga la copa en una ranura de transferencia nuclear. Encienda el dispositivo de nucleofección con el botón de encendido y seleccione el procedimiento de transfección U-033.
Cuando finalice el programa, pulse el botón X del dispositivo de nucleofección y la pantalla mostrará OK, lo que indica que la nucleofección se ha realizado correctamente. Añadir 0,5 a un mililitros del medio de águila modificada de Dulbecco a la copa de nucleofección para detener la reacción. Después de mezclar suavemente, transfiera la suspensión a un tubo de 1,5 mililitros.
Inocular los parásitos nucleo infectados en pollos de siete días de edad. Inocular los merozoitos de Eimeria necatrix o los esporozoitos de Eimeria tenella a través de la vía cloacal, pero inocular Eimeria acervulina sporozoites mediante inyección intravenosa. Después de recolectar ovocitos de las heces, utilice la clasificación celular activada por fluoresceína y 150 miligramos por kilogramo de pirimetamina para aumentar la proporción de población transgénica.
Este protocolo se ha utilizado para transfecitar parásitos eimerios. En este estudio, aquí se muestran los meronts y merozoites de Eimeria necatrix, así como los esporocitos y esporozoitos de la tenella de Eimeria después de utilizar las soluciones de gradiente de densidad. Las imágenes de los ovocitos de Eimeria necatrix después de infectar con los merozoitos nucleo infectados y los ovocitos de Eimeria tenella después de infectar con espozoitos nucleo infectados indican una nucleofección exitosa.
Lo más importante al intentar este procedimiento es asegurarse de que la purificación de los esporozoitos y los merozoitos sean exitosos y utilizar la solución de gradiente de densidad del 50% para eliminar el OS2 mientras se asegura de que los esporocitos y los esporozoitos estén más purificados. Después de este procedimiento, puede optimizar este protocolo, como transfectar o espoquisto para simplificar los procedimientos de transfección de los parásitos de Eimeria en el futuro. Con el desarrollo de la transfección en Eimeria, la tecnología CRISPR-Cas9 en Eimeria será previsible para presentar significativamente la manipulación genética cautelosa de Eimeria y ser aplicada como un vehículo de administración de vacunas adecuado.
