Eimeria türleri için transfeksiyon protokollerinin oluşturulması gen fonksiyonlarının incelenmesine, yeni aşıların geliştirilmesine ve Eimeria için yeni ilaç hedeflerinin taranmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniği kullanarak, Eimeria'nın çeşitli türlerinin transfeksiyonuna ulaştık ve nükleofeksiyon eimerian parazitlerde genetik manipülasyon uygulamasını kolaylaştırmak için yararlı bir araçtır. Eimeria'nın çekirdekleri, in vitro olarak kültüre geçirilemeyecek diğer parazitlerin transfeksiyonu için bir referans sağlar ve genetik manipülasyon çalışmalarını hızlandırır.
Bu tekniği ilk kez denerseniz, deney sırasında çırpınmamak için transfeksiyon başlamadan önce tüm reaktifleri ve aletlerini iyi hazırlamalısınız. Bu yöntemin gerçekleştirilmesi, Eimeria'nın transfeksiyonuna odaklanan insanların bu deneyin karmaşık ayrıntılarını görmelerine yardımcı olur. Sporokistlerin salınımı ile başlamak için, potasyum dikromat çözeltisi içinde yedi sporlu ookistler bir kez 10 2, 5 dakika için 300 kez g santrifüj.
PBS ile üç kez yıkayın. PBS bir mililitre ile pelet resuspend ve 15 mililitrelik bir tüp karışımı aktarın. Bir milimetre çapında cam boncuk eşit hacim ekleyin ve sporokistler serbest bırakmak için bir girdap karıştırıcı kullanarak ookist süspansiyon salınım.
Her dakika, mikroskopi ile sporokistlerin salınımını izlemek. Ookistlerin %90'ından fazlası kırıldığında girdaplamayı bırakın. Sporokist süspansiyonu yeni 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve santrifüj1, 600 kez g beş dakika.
Çökeltiyi %50 yoğunlukgradient çözeltinin mililitresi ile yeniden askıya alın ve 10,000 kez g'de bir dakika santrifüj edin. Sporozoitleri serbest bırakmak için, ekssistosit tamponu ile çökelti yeniden askıya almak ve sporozoitler serbest bırakmak için 40 ila 60 dakika boyunca 42 derece santigrat su banyosu kuluçka. Ekssestasyon sırasında tüpleri her beş dakikada bir çalkalayın.
Sporozoitlerin %90'ından fazlası serbest bırakıldığında kuluçkayı bırakın. 10 dakika boyunca 600 kez g santrifüj. %55 yoğunlukgradient çözeltinin mililitresi ile yağışı yeniden askıya alın ve tüpü 10,000 kez g'de bir dakika santrifüj edin.
PBS bir mililitre ile yağış resuspend ve bir hemositometre kullanarak sporozoitler saymak. Eimeria necatrix ikinci nesil merozoites toplamak için, ileocekal orifice sarısı sapı uzunlamasına tavuk bağırsağı kesti ve hafifçe bir Petri kabında PBS veya HBSS ile üç kez yıkayın. Parçalara bağırsak kesin ve bir sindirim tampon ile konik bir şişe yerleştirin.
Merozoitler serbest bırakmak için 30 ila 60 dakika karıştırma çubuğu ile 37 santigrat derece bir manyetik karıştırıcı üzerine şişe yerleştirin. Kuluçka 30 dakika sonra, mikroskobik inceleme ile her beş dakikada bir merozoitlerin salınımını izlemek. Merozoitleri arındırmak için, sindirilmiş merozoitleri içeren süspansiyonu gazlı bezin dört katmanı üzerine dökün ve tüpleri 10 dakika boyunca 600 kez g'de santrifüj edin.
Santrifüjden sonra, bağırsak enkaz içeren supernatant atın. Saflaştırılmış merozoitlerle yağışı 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. PBS bir mililitre ile yağış resuspend ve bir hemositometre kullanarak merorositler saymak.
İlk olarak, 10 dakika boyunca 600 kez g sporozoit veya merozoit süspansiyon santrifüj. Sonra supernatant atın. Aşağıdaki sırayla, sporozoitler veya merozoitler içeren 1.5 mililitrelik tüp içine nükleer transfeksiyon tampon85 mikrolitre, plazmid 10 mikrogram ve restriksiyon enzim 25 birim ekleyin.
Süspansiyonu nükleer transfeksiyon kabına aktarın. Bardağı nükleer transfer oluğuna koy. Güç düğmesini kullanarak nükleofection cihazını açın ve U-033 transfeksiyon prosedürünü seçin.
Program bittiğinde, nükleofection cihazının X düğmesine basın ve ekran tamam'ı görüntüleyerek nükleofection'ın başarılı olduğunu gösterir. Reaksiyonu durdurmak için çekirdeklik kabına 0,5 ila bir mililitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta ekleyin. Yavaşça karıştırdıktan sonra süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Çekirdekleri yedi günlük tavuklara dönüştürün. Eimeria necatrix meozoitler veya kloakal rota ile Eimeria tenella sporozoitler aşılamak, ama intravenöz enjeksiyon yoluyla Eimeria acervulina sporozoitler inoculate. Dışkıookistler topladıktan sonra, transgenik popülasyon oranını artırmak için floresan aktive hücre sıralaması ve kilogram başına 150 miligram pirimememin kullanın.
Bu protokol eimerian parazitleri nakletmek için kullanılmıştır. Bu çalışmada, Eimeria necatrix'in ikinci nesil merontları ve merozoitleri ve yoğunluk gradyan solüsyonlarını kullandıktan sonra Eimeria tenella'nın sporokistleri ve sporozoitleri burada gösterilmiştir. Eimeria necatrix ookistlerinin nükleofekted merozoitler ve eimeria tenella ookistleri ile nükleofektomi sporozoitler ile enfekte sonra enfekte sonra görüntüleri başarılı nükleofection gösterir.
Bu prosedürü denerken en önemli şey sporozoitlerin ve meroozitlerin arınmasını sağlamak ve sporokistlerin ve sporozoitlerin daha saf olduğundan emin olurken OS2'yi çıkarmak için %50 yoğunlukgradient çözeltisini kullanmaktır. Bu prosedürü takiben, gelecekte Eimeria parazitlerinin transfeksiyon prosedürlerini basitleştirmek için ookist veya sporokist transfeksiyonu gibi bu protokolü optimize edebilirsiniz. Eimeria transfeksiyon gelişimi ile, Eimeria CRISPR-Cas9 teknolojisi önemli ölçüde Eimeria ihtiyatlı genetik manipülasyon ortaya koymak ve uygun bir aşı dağıtım aracı olarak uygulanacak beklenebilir olacaktır.
