La definizione di protocolli di trasfezione per le specie Eimeria aiuterebbe a far progredire lo studio delle funzioni geniche, sviluppando nuovi vaccini e vagliando nuovi obiettivi farmacologici per Eimeria. Usando questa tecnica, abbiamo raggiunto la trasfezione di diverse specie di Eimeria e la nucleofezione è uno strumento utile per facilitare l'applicazione della manipolazione genetica nei parassiti eimeriani. La nucleofezione di Eimeria fornisce un riferimento per la trasfezione di altri parassiti che non possono essere coltivati in vitro e accelereranno lo studio della loro manipolazione genetica.
Se provi questa tecnica per la prima volta, dovresti preparare bene tutti i reagenti e i loro strumenti prima dell'inizio della trasfezione per evitare la corsa durante l'esperimento. La realizzazione di questo metodo aiuta le persone che si concentrano sulla trasfezione di Eimeria a vedere gli intricati dettagli di questo esperimento. Per iniziare con il rilascio di sporocista, centrifugare uno per 10 alle sette ovocitosi sporulate in soluzione di dicromato di potassio a 2.300 volte g per cinque minuti.
Lavarli con PBS tre volte. Resuspend il pellet con un millilitro di PBS e trasferire la miscela in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere un volume uguale di perline di vetro di un millimetro di diametro e oscillare la sospensione di oocista utilizzando un miscelatore a vortice per rilasciare le sporocche.
Ogni minuto, monitorare il rilascio di sporocici per microscopia. Quando più del 90% delle ooc cisti è rotto, interrompere il vortice. Trasferire la sospensione sporocista in nuovi tubi da 1,5 millilitri e centrifugare a 1.600 volte g per cinque minuti.
Rimescolare il precipitato con un millilitro di soluzione gradiente di densità del 50% e centrifugare a 10.000 volte g per un minuto. Per rilasciare sporozoiti, rimescolare il precipitato con tampone di estinazione e incubare in un bagno d'acqua Celsius di 42 gradi per 40-60 minuti per rilasciare le sporozoiti. Agitare i tubi una volta ogni cinque minuti durante l'estinazione.
Quando viene rilasciato più del 90% delle sporozoiti, interrompere l'incubazione. Centrifuga a 600 volte g per 10 minuti. Riprendono le precipitazioni con un millilitro di soluzione gradiente di densità del 55% e centrifuga il tubo a 10.000 volte g per un minuto.
Rimescolare le precipitazioni con un millilitro di PBS e contare le sporozoiti usando un emocitometro. Per raccogliere le merozoiti di seconda generazione di Eimeria necatrix, tagliare l'intestino di pollo longitudinalmente dal gambo del tuorlo all'orifizio ileocecale e lavarlo delicatamente con PBS o HBSS tre volte in una piastra di Petri. Tagliare l'intestino a pezzi e metterli in un pallone conico con un tampone di digestione.
Posizionare il pallone su un mixer magnetico a 37 gradi Celsius con una barra di agitazione per 30-60 minuti per rilasciare merozoiti. Dopo 30 minuti di incubazione, monitorare il rilascio di merozoiti mediante esame microscopico ogni cinque minuti. Per purificare le merozoiti, versare la sospensione contenente merozoiti digerite su quattro strati di garza per filtrare in tubi da 50 millilitri e centrifugare i tubi a 600 volte g per 10 minuti.
Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante contenente detriti intestinali. Trasferire le precipitazioni con merozoiti purificate in tubi da 1,5 millilitri. Rimescolare le precipitazioni con un millilitro di PBS e contare le merozoiti usando un emocitometro.
In primo luogo, centrifugare la sospensione di sporozoite o merozoite a 600 volte g per 10 minuti. Quindi scartare il supernatante. Nell'ordine seguente aggiungere 85 microlitri di tampone di trasfezione nucleare, 10 microgrammi di plasmide e 25 unità di enzima di restrizione nel tubo da 1,5 millilitri contenente sporozoiti o merozoiti.
Trasferire la sospensione in una tazza di trasfezione nucleare. Metti la tazza in un solco di trasferimento nucleare. Accendere il dispositivo di nucleofezione utilizzando il pulsante di accensione e selezionare la procedura di trasfezione U-033.
Al termine del programma, premere il tasto X del dispositivo di nucleofezione e lo schermo viene visualizzato OK, indicando che la nucleofezione ha esito positivo. Aggiungere 0,5 a un millilitri del Mezzo dell'Aquila Modificata di Dulbecco alla tazza di nucleofezione per fermare la reazione. Dopo aver mescolato delicatamente, trasferire la sospensione su un tubo da 1,5 millilitri.
Inoculare i parassiti nucleofettati in polli di sette giorni. Inoculare le merozoiti di Eimeria necatrix o le sporozoiti di Eimeria tenella attraverso la via cloacale, ma inoculare Eimeria acervulina sporozoiti attraverso iniezione endovenosa. Dopo aver raccolto oocista dalle feci, utilizzare lo smistamento cellulare attivato dalla fluoresceina e 150 milligrammi per chilogrammo di pirimetamina per aumentare il rapporto trasgenico della popolazione.
Questo protocollo è stato utilizzato per trasfetto i parassiti eimeriani. In questo studio, qui sono mostrati i meront e i merozoiti di seconda generazione di Eimeria necatrix, così come le sporocici e le sporozoiti di Eimeria tenella dopo aver usato le soluzioni di gradiente di densità. Le immagini degli oocici di Eimeria necatrix dopo aver infettato con le merozoiti nucleofette e gli oocici di Eimeria tenella dopo aver infettato con sporozoiti nucleofette indicano una nucleofezione riuscita.
La cosa più importante durante il tentativo di questa procedura è assicurarsi che la purificazione di sporozoiti e merozoiti abbia successo e utilizzare la soluzione gradiente di densità del 50% per rimuovere l'OS2 assicurandosi che le sporocisti e le sporozoiti siano più purificate. Seguendo questa procedura, è possibile ottimizzare questo protocollo, come il trasfetto di oocista o sporocista per semplificare le procedure di trasfezione dei parassiti Eimeria in futuro. Con lo sviluppo della trasfezione in Eimeria, la tecnologia CRISPR-Cas9 in Eimeria sarà in attesa di proporre in modo significativo la cauta manipolazione genetica di Eimeria e di essere applicata come veicolo di somministrazione di vaccini adatto.
