O estabelecimento de protocolos de transfecção para espécies de Eimeria ajudaria a avançar no estudo das funções genéticas, desenvolvendo novas vacinas e rastreando novos alvos de medicamentos para a Eimeria. Usando essa técnica, conseguimos a transfecção de várias espécies de Eimeria, e a nucleofecção é uma ferramenta útil para facilitar a aplicação da manipulação genética em parasitas eimerianos. A nucleofecção de Eimeria fornece uma referência para a transfecção de outros parasitas que não podem ser cultivados in vitro e acelerarão o estudo de sua manipulação genética.
Se você tentar esta técnica pela primeira vez, você deve preparar bem todos os reagentes e seus instrumentos antes do início da transfecção para evitar embaralhar durante o experimento. A realização deste método ajuda as pessoas que se concentram na transfecção de Eimeria a ver os detalhes intrincados deste experimento. Para começar com a liberação de esporos, centrífuga uma vez 10 para os sete oocistos esporulados em solução de dicromato de potássio a 2.300 vezes g por cinco minutos.
Lave-os com PBS três vezes. Resuspenda a pelota com um mililitro de PBS, e transfira a mistura para um tubo de 15 mililitros. Adicione um volume igual de contas de vidro de um milímetro de diâmetro e oscile a suspensão oocisto usando um misturador de vórtice para liberar os esporostos.
A cada minuto, monitore a liberação de esporoscitos por microscopia. Quando mais de 90% dos oocistos estão quebrados, pare de vórtice. Transfira a suspensão do esporócito para novos tubos de 1,5 mililitro e centrífuga a 1.600 vezes g por cinco minutos.
Resuspend o precipitado com um mililitro de solução de gradiente de densidade de 50%, e centrífuga a 10.000 vezes g por um minuto. Para liberar os esporozoitas, resuspensar o precipitado com tampão de extiução, e incubar em um banho de água Celsius de 42 graus por 40 a 60 minutos para liberar os sporozoitas. Agite os tubos uma vez a cada cinco minutos durante a excisão.
Quando mais de 90% dos esporozoitas forem liberados, pare de incubar. Centrifugar a 600 vezes g por 10 minutos. Resuspengue a precipitação com um mililitro de solução de gradiente de densidade de 55%, e centrifuge o tubo a 10.000 vezes g por um minuto.
Resuspend a precipitação com um mililitro de PBS, e conte os esporozoitas usando um hemótmetro. Para coletar os merozoites de segunda geração de Eimeria necatrix, corte o intestino de frango longitudinalmente do talo da gema até o orifício ileocecal, e lave-o com PBS ou HBSS suavemente três vezes em uma placa de Petri. Corte o intestino em pedaços, e coloque-os em um frasco cônico com um tampão de digestão.
Coloque o frasco em uma batedeira magnética a 37 graus Celsius com uma barra de agitação por 30 a 60 minutos para liberar merozoitas. Após 30 minutos de incubação, monitore a liberação de merozoites por exame microscópico a cada cinco minutos. Para purificar os merozoitas, despeje a suspensão contendo merozoites digeridos sobre quatro camadas de gaze para filtrar em tubos de 50 mililitros e centrifugar os tubos a 600 vezes g por 10 minutos.
Após a centrifugação, descarte o sobrenatante contendo detritos do intestino. Transfira a precipitação com merozoitas purificados para tubos de 1,5 mililitros. Resuspend a precipitação com um mililitro de PBS, e conte os merozoitas usando um hemótmetro.
Primeiro, centrifugar a suspensão de sporozoita ou merozoita a 600 vezes g por 10 minutos. Então descarte o supernaspeso. Na ordem seguinte, adicione 85 microlitadores de tampão de transfecção nuclear, 10 microgramas de plasmídeos e 25 unidades de enzima de restrição no tubo de 1,5 mililitro contendo esporozoitas ou merozoitas.
Transfira a suspensão para um copo de transfecção nuclear. Coloque o copo em um sulco de transferência nuclear. Ligue o dispositivo de nucleofecção usando o botão de alimentação e selecione o procedimento de transfecção U-033.
Quando o programa terminar, pressione o botão X do dispositivo de nucleofecção e a tela seja exibida OK, indicando que a nucleofecção é bem sucedida. Adicione 0,5 a um mililitro do Meio de Águia Modificada de Dulbecco ao copo de nucleofecção para parar a reação. Depois de misturar suavemente, transfira a suspensão para um tubo de 1,5 mililitro.
Inocular os parasitas nucleofectados em galinhas de sete dias. Inocular os merozoitas de Eimeria necatrix ou os esporozoitas de Eimeria tenella através da rota cloacal, mas inoculado Eimeria acervulina sporozoites através de injeção intravenosa. Depois de coletar oocistos de fezes, use a classificação celular ativada por fluoresceína e 150 miligramas por quilograma de pirimetamina para aumentar a proporção populacional transgênica.
Este protocolo tem sido usado para transfetar parasitas eimerianos. Neste estudo, os merontes de segunda geração e merozoitas de Eimeria necatrix são mostrados aqui, bem como os esporócitos e esporozoitas de Eimeria tenella após o uso das soluções gradientes de densidade. As imagens dos oocistos de Eimeria necatrix após infectar com os merozoitas nucleofectados e os oocistos de Eimeria tenella depois de infectar com esporozoitas nucleofectados indicam nucleofeipulação bem sucedida.
O mais importante ao tentar este procedimento é garantir que a purificação de esporozoitas e merozoitas seja bem sucedida e usar a solução de gradiente de densidade de 50% para remover o OS2, certificando-se de que os esporozoitas e os esporozoitas sejam mais purificados. Seguindo este procedimento, você pode otimizar este protocolo, como transfecionar oocisto ou esporócito para simplificar os procedimentos de transfecção de parasitas Eimeria no futuro. Com o desenvolvimento da transfecção em Eimeria, a tecnologia CRISPR-Cas9 em Eimeria será esperançosa de apresentar significativamente a cautelosa manipulação genética da Eimeria e ser aplicada como um veículo adequado de entrega de vacinas.
