트랜스제닉 동물은 살아있는 유기체에서 유전자 기능의 연구를 허용하기 때문에 현대 생물 의학 연구의 기본입니다. 동물 연구에서 다양한 유전자 변형 방법이 적용되었습니다. 여기서, 우리는 쥐 배아의 게놈으로 유전자 통합을 위한 공구로 렌즈티바이러스 벡터를 사용하는 널리 접근가능하고 효과적인 기술을 제시합니다.
인간의 융냉성 생식선 호르몬 관리 후, 5 주 된 Wistar 여성 쥐 1 대 1을 성적으로 비옥한 3 ~10 개월 된 Wistar 남성으로 짝짓기. 8~10a.m. 다음날 아침, 암컷에게 질 플러그의 존재를 확인하고 10 a.m 이상짝 짓기 플러그를 가진 암컷에게서 oviducts를 수확하십시오.
미리 데워진 M2 배지가 포함된 컬렉션 접시에 넣습니다. 모든 난소가 수집되면, 전워진 M2 배지를 함유한 35mm 접시에 소변 고환에서 히알루로니다아제 밀리리터당 0.5밀리그램으로 보충하여 스테레오 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 미세 한 집게를 사용하여 배반의 벽을 열고 배아가 풀려날 때까지 암풀라를 누릅니다.
적혈구로부터 배아의 방출을 용이하게하기 위해, 입으로 작동하는 아스피러 튜브에 연결된 유리 이송 파이펫을 사용하여 배아를 위아래로 부드럽게 피펫하십시오. 모든 배아가 방출되면, 히알루로니다제와 세포 이물질을 제거하기 위해 신선한 M2 배지에서 세포를 몇 번 세척한다. 60mm 접시에 미네랄 오일로 덮여 미리 평형 M16 매체의 개별 50 마이크로 리터 방울로 배아를 전송.
그런 다음 접시를 주입 할 때까지 5 %의 이산화탄소 대기와 가습 된 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. 1세포 단계 배아의 조나 펠루시다 하에서 렌티바이러스 벡터 미세 주입의 경우 파이펫 풀러를 사용하여 필라멘트가 있는 미세 주입 보로실리케이트 유리 모세혈관을 준비합니다. 필라멘트가 변경되었거나 새 유리 모세관을 사용할 때마다 램프 테스트를 실행하여 최적의 매개 변수를 설정합니다.
다음으로, 마이크로로더 팁을 사용하여 생물 안전 라미나르 유동 후드 아래에 미세 주입 파이펫 당 약 2 개의 새로 해동 된 렌즈티바이러스 용액을 적재하십시오. 60mm 페트리 접시에서 뚜껑 중앙에 100 마이크로리터 드롭을 추가합니다. 미네랄 오일로 매체를 덮고 지주 파이펫과 마이크로 조작기에 미세 주입 모세관을 탑재하십시오.
마이크로 주입 접시를 반전 된 현미경 아래에 놓고 15 ~ 20 개의 1 세포 단계 배아를 미세 주입 접시의 M2 드롭으로 옮기. 포획 파이펫으로 하나의 배아를 캡처하고 400배감과 유리 모세관을 사용하여 조나 펠루시다 하에서 렌티바이러스 용액을 주사하여 바이러스가 전달된 후 잠시 동안 조나 펠루시다 아래에 모세혈관을 들고 있는 인식 공간에 주입한다. 모든 배아가 주입되었을 때, 주입된 세포를 배양 접시에 반환하고 이식될 때까지 세포 배양 배양 인큐베이터로 접시를 되돌려 주세요.
배아 전이를 위해 수양 모를 준비하기 위해, 혈관질이 있는 남성과 성적으로 성숙한 스프라그-Dawley 암컷을 짝짓기하고 다음 아침 에 암컷에게 질 플러그를 확인하십시오. 실행 가능한 플러그를 가진 마취 된 여성의 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 동물의 눈에 연고를 적용하고 각 동물의 뒷면에서 모피를 면도. 수술 현미경의 밑에 가열 패드에 깨끗한 표면에 있는 경향이 있는 위치에 첫번째 쥐를 놓습니다.
쥐를 허리에 잘라 작은 구멍으로 멸균 커튼으로 덮고 요추 척추 기둥과 평행한 약 2 센티미터 피부 절개를합니다. 날카로운 가위를 사용하여 복벽에 자르고 집게를 사용하여 난소 지방 패드를 잡습니다. 난소와 배란을 복강에서 꺼내서 0.9%의 염화나트륨에 담근 거즈를 넣습니다.
M2 배지, 공기 의 세 거품 및 배아를 이송 모세관으로 로드합니다. 미수부를 사용하여 인펀디불룸과 암풀라 사이의 oviduct에 작은 절개를 하고 이송 파이펫의 끝을 절개에 삽입합니다. 배아와 기포를 oviduct로 부드럽게 추방한 다음 무딘 집게를 사용하여 생식 기관을 복강으로 다시 배치합니다.
폴리 글리콜산 흡수 봉합사복으로 복벽을 봉합하고 상처 클립으로 피부 절개를 닫고 동물이 완전한 재조정이 끝날 때까지 모니터링하여 따뜻한 접시에 깨끗한 케이지에 놓습니다. 잠재적 인 동료를 혈관질, 입증 된 대로 수술을 위해 남성 쥐를 준비 한 후, 70 %에탄올과 고환을 통해 피부를 소독하는 수술 스크럽을 사용합니다. 복부를 부드럽게 눌러 음낭낭의 고환을 노출시키고 수술 부위에 작은 구멍이있는 멸균 드레이프로 쥐를 덮고 음낭 중간에 0.5 센티미터 절개를 만듭니다.
조심스럽게 왼쪽으로 고환을 밀어 하나의 혈관과 흰색 덕트로 고환과 중간선 사이의 vas deferens를 찾습니다. 워치메이커의 집게를 사용하여 음로 낭에서 꽃병을 부드럽게 당기고 배를 집게로 잡고 미세 가위를 사용하여 덕트에서 1센티미터 조각을 제거합니다. 단지 입증된 대로 두 번째 고환에 대한 절차를 반복하고 폴리 글리콜산 흡수 봉합사로 피부를 닫습니다.
그런 다음 쥐를 완전한 재조정이 될 때까지 모니터링하여 온난화 접시에 깨끗한 케이지에 넣습니다. 단일 배아를 여러 번 주입한 이 대표적인 실험에서는 8마리의 쥐가 두 번 주사된 배아로부터 태어났으며, 그 중 3마리는 트랜스진을 운반하는 것으로 확인되었다. 창립자 중 한 명은 자손에게 트랜스진을 옮기지 않았고 각 실험 용 설정에 3 명의 위탁 여성이 사용되었습니다.
선택된 접근법은 중추 신경계 전반에 걸쳐 하나의 프로모터에서 신경 시냅스의 통제 하에 TDP-43-eGFP 융합 단백질을 발현하는 안정적인 형질전환 쥐 라인의 생성을 허용했다. 렌티바이러스 계의 전염은 정량적 PCR에 의해 입증된 바와 같이 트랜스진의 단일 카피 삽입을 초래했다. 이 방법이 다른 렌티바이러스 벡터에 사용될 때, 약 90%의 생존율이 관찰되었다.
비핵화 주사에서 살아남은 배아의 비율은 현저히 낮았다. 전반적으로, 이 결과는 임신한 여성 쥐가 비교 가능한 효율성을 가진 수양 어머니로 사용될 수 있다는 것을 건의합니다. 특히, 미세 주입의 개별 라운드를 위해 분석된 수치 데이터는 이식의 효과가 1개의 태아로 의한 주사 수에 직접적으로 의존하고 바이러스 부하에 간접적으로 의존한다는 것을 표시했습니다.
렌티바이러스 벡터의 사용은 트랜스진의 게놈 통합 및 전송을 보장하고 다중 피하 주사가 수행되는 경우에도 미세 조작 된 배아의 높은 생존율을 용이하게한다. 이 절차는 다른 종에 효과적으로 적용될 수 있고 전통적인 전염을 위한 대안으로 간주될 수 있습니다.
