使用伦迪病毒载体方法生成转基因大鼠

转基因动物是现代生物医学研究的根本，因为它们允许研究生物体中的基因功能。各种基因修饰方法已应用于动物研究。在这里，我们提出了一种广泛可获取和有效的技术，它使用扁病毒载体作为将转基因纳入大鼠胚胎基因组的工具。

人类胆胃性腺激素给后，交配五周大的威斯塔雌性大鼠一对一与性肥沃的三到十个月大的维斯塔雄性。第二天上午8.m，检查女性是否存在阴道塞，并在不迟于上午10点之前用交配塞从雌性中采集.m。

放入含有预热 M2 介质的收集盘中。当所有风管都收集起来后，将组织转移到一个35毫米的培养皿中，其中含有预热的M2介质，并辅以每毫升牛睾丸0.5毫克的透明酶，然后将培养皿置于立体显微镜下。使用精细钳子打开卵巢壁，然后按压安培，直到胚胎释放。

为了便于从积液细胞中释放胚胎，请使用连接到嘴操作吸管的玻璃转移移液器，轻轻地上下移液胚胎。当所有胚胎都被释放后，用新鲜的M2介质清洗细胞几次，以去除透明和细胞碎片。将胚胎移植到60毫米培养皿中由矿物油覆盖的预平衡M16介质的单个50微升滴中。

然后将盘子放入加湿的37摄氏度培养箱中，其二氧化碳含量为5%，直到其注入。对于单细胞阶段胚胎的佐纳佩普利达下的扁病毒载体微注射，使用移液器拉拔器用灯丝准备微注射硅酸盐玻璃毛细管。每次更换灯丝或使用新的玻璃毛细管后，运行 Ramp 测试以设置最佳参数。

接下来，使用微装载机尖端，在生物安全层流罩下，每个微注射移液器装载大约两升新鲜解冻的扁病毒溶液。从 60 毫米培养皿中向盖子中央添加 100 微升的 M2 介质。用矿物油盖住介质，将保持移液器和病毒加载的微注射毛细管安装到微操纵器上。

将微注射盘置于倒置显微镜下，将15至20个单细胞阶段胚胎转移到微注射盘中的M2滴中。用持有移液器捕获一个胚胎，并使用 400 倍的放大倍率和玻璃毛细管将佐纳佩普鲁西达下的扁病毒溶液注射到周围空间中，在病毒传递后将毛细管放在左皮利西达下一会儿。当所有胚胎都注射后，使用细移液器将注射的细胞返回到培养皿中，然后将培养皿返回到细胞培养箱，直到植入。

为了准备养母的胚胎移植，交配性成熟的斯普拉格-道利雌性与输精管切除术的男性，并检查女性第二天早上阴道插头。在确认麻醉雌性女性对踏板反射缺乏反应后，用可行的插头涂抹软膏，从动物的背上剃皮毛。将第一只老鼠放在手术显微镜下加热垫上的清洁表面上。

用无菌窗帘盖住大鼠，下背部有一个小孔，使大约两厘米的皮肤切口平行于腰椎柱。使用锋利的剪刀在腹壁上做切口，用钳子抓住卵巢脂肪垫。将卵巢和卵巢从腹腔中拉到一块 0.9% 氯化钠浸泡纱布上。

将M2介质、三个气泡的空气和胚胎加载到转移毛细管中。使用微切口将小切口切入导管和安普拉之间的卵巢，并将转移移液器的尖端插入切口。轻轻地将胚胎和气泡排入卵巢，然后用钝钳将生殖道放回腹腔。

用多糖酸可吸收缝合腹壁，用伤口夹关闭皮肤切口，将动物放在加热板上的清洁笼子里，监测直至完全下部。要对潜在的伴侣进行输精管切除术，在证明雄性大鼠进行手术后，使用70%乙醇和手术磨砂来消毒睾丸上的皮肤。轻轻按压腹部，露出阴囊中的睾丸，用无菌窗帘盖住大鼠，手术部位上有一个小洞，然后用阴囊剪刀在囊中间做一个0.5厘米的切口。

小心地将睾丸向左推，将睾丸和中线之间的血管定位为带单血管的白色导管。使用制表师的钳子轻轻地将血管从阴囊中拉出，用钳子握住容器，用细剪刀从管道中去除一厘米的碎片。重复第二个睾丸的过程，正如刚刚演示的，并关闭皮肤与多糖酸可吸收缝合线。

然后将老鼠放入加热板上的清洁笼中，进行监测，直到完全恢复。在这个代表性的实验中，单个胚胎被注射多次，8只大鼠从两次注射的胚胎中出生，其中3只被证实携带转基因。其中一个创始人没有将转基因转移到后代身上，每个实验装置都使用了三个寄养雌性。

选择的方法允许生成稳定的转基因大鼠系，在神经突触的控制之下，在整个中枢神经系统的一个促进物中表达TDP-43-eGFP融合蛋白。基于伦蒂病毒的转生成导致转基因的单一拷贝插入，如定量 PCR 所证明的。当此方法用于其他扁病毒载体时，观察到大约 90% 的存活率。

在亲核注射中幸存下来的胚胎比例要低得多。总的来说，这些结果表明，怀孕的雌性大鼠可以作为具有同等效率的养母。值得注意的是，对个别几轮微注射进行分析的数值数据表明，植入的有效性直接取决于注射到一个胚胎的数量，并间接取决于病毒载量。

使用扁病毒载体保证了转基因的基因组整合和传输，并有利于微管理胚胎的高存活率，即使进行了多次次皮下注射。这个过程可以有效地应用于其他物种，并可以被认为是常规转世的替代方案。